Pectina citrică modificată termic induce moartea celulară ca apoptoza și autofagia în celulele canceroase HepG2 și A549.

Leclere L1Fransolet M1Cote F1Cambier P2Arnould T1Van Cutsem P2Michiels C.

Pectina citrică modificată termic induce moartea celulară ca apoptoza și autofagia în celulele canceroase HepG2 și A549.

Leclere L1Fransolet M1Cote F1Cambier P2Arnould T1Van Cutsem P2Michiels C1.

INFORMAȚII DESPRE AUTORI

REZUMAT

Cancerul este în continuare una dintre principalele cauze de deces la nivel mondial, iar găsirea de noi tratamente rămâne o provocare majoră. Studiile anterioare au arătat că formele modificate de pectină, o polizaharidă complexă prezentă în peretele celular al plantelor, prezintă proprietăți anticanceroase. Cu toate acestea, mecanismul de acțiune al pectinei modificate și căile implicate sunt neclare. Aici, vom arăta cum pectina citrică modificată prin tratament termic a indus moartea celulară în celulele HepG2 și A549. Moartea celulară indusă diferă de apoptoza clasică deoarece nu a fost observată scindarea ADN-ului. În plus, Z-VAD-fmk, un inhibitor de pan-caspază, nu a influențat moartea celulară observată în celulele HepG2, dar a părut a fi parțial protector în celulele A549, ceea ce indică faptul că pectina citrică modificată termic poate induce moartea celulară independent de caspază. S-a observat o creștere a abundenței proteinei cu lanț ușor 3 (LC3) conjugate cu fosfatidiletanolamină și o scădere a abundenței de proteine ​​p62 în ambele tipuri de celule atunci când au fost incubate în prezența pectinei citrice modificate termic. Aceste rezultate indică activarea autofagiei. Din cunoștințele noastre, aceasta este prima dată când autofagia a fost descoperită în celulele incubate în prezența unei forme modificate de pectină. Această activare autofagică pare a fi protectivă, cel puțin pentru celulele A549, deoarece inhibarea acesteia cu 3-metiladenină a crescut citotoxicitatea indusă de pectina modificată. Acest studiu confirmă potențialul pectinei modificate de a îmbunătăți tratamentul cancerului tratat chimioterapeutic.

PMID:

25794149

PMCID:

PMC4368604

DOI:

10.1371/journal.pone.0115831

[Indexat pentru MEDLINE]

Articol PMC gratuit

Pectina citrică modificată termic induce moartea celulară ca apoptoza și autofagia în celulele canceroase HepG2 și A549.

Lionel Leclere,1 Maude Fransolet,1 Francois Cote,1 Pierre Cambier,2 Thierry Arnould,1Pierre Van Cutsem2 și Carine Michiels1,*

Daolin Tang,  Editor academic

Informații despre autori ► Note despre articol ► Informații despre drepturile de autor și licențăPrecizări legale

Acest articol a fost citat de alte articole din PMC.

Rezumat

Mergi la:

INTRODUCERE

Cancerul rămâne una dintre principalele cauze de deces la nivel mondial. În ciuda unei game largi de abordări terapeutice, cancerul nu poate fi ușor vindecat, iar multe tipuri de cancer au o rată scăzută de vindecare. Deși esențială pentru tratament, chimioterapia și radioterapia sunt, de asemenea, surse de numeroase efecte secundare, iar chirurgia poate omite uneori metastaze. Acestea sunt motivele pentru care dezvoltarea de noi terapii pentru îmbunătățirea tratamentelor existente este o provocare majoră. Compușii naturali și fitochimicalele au început recent să se bucure de un interes deosebit pentru capacitatea lor de a modula căile de semnalizare implicate în proliferarea și metastazarea cancerului sau pentru potențialul lor de protecție în radioterapie, așa cum este analizat de Hazra [1].

Pectinele sunt componente abundente și complexe ale peretelui celular de plante primare și sunt bine cunoscute ca fibre alimentare. Polizaharidele pectină includ homogalacturonanul (HG), galacturonanele substituite, ramnogalacturonanul-I (RG-I) și ramnogalacturonanul-II (RG-II). HG este un polimer al acidului D-galacturonic α-1,4-legat, iar reziduurile HG pot fi esterificate cu metil la carboxil C-6 sau acetilate la O-2 sau O-3, în funcție de sursa de pectină. Magistrala HG este reticulată covalent cu RG-I și RG-II. RG-I este un polimer ramificat cu o magistrală de dizaharidă repetată (α-1,4-D-GalA-α-1,2-LRha) în care resturile Rha pot fi substituite cu β-1,4-galactan, lanțuri laterale ramificate de arabinan și/sau arabinogalactan. Structura RG-II este foarte complexă: lanțurile laterale sunt atașate la o magistrală HG, iar aceste lanțuri laterale complexe sunt compuse din 12 tipuri de resturi de glicozil legate între ele de cel puțin 22 de legături glicozidice diferite [2, 3].

Mai multe studii in vitro au arătat că diferite forme de pectină modificată au proprietăți antitumorale (pentru o analiză, consultați [4]). Regiunea RG-I a pectinei din bame reduce proliferarea și induce apoptoza în celulele melanomului [5], iar oligozaharidele de pectină induc, de asemenea, apoptoza în celulele mielomului [6]. Jackson și colab. au arătat că diferite protocoale de fragmentare a pectinei pot duce la diferențe în activitatea de inducere a apoptozei de pectină și că pectina fragmentată are un efect citotoxic în celulele cancerului de prostată, dependent și independent de androgeni. În plus, acești autori au arătat că pectina citrică modificată cu pH a avut activitate apoptotică redusă sau deloc [7]. In vivo, s-a arătat că angelanul, o polizaharidă derivată din pectină, ar putea împiedica creșterea celulelor melanomului și metastazele, raportându-se, de asemenea, că angelanul este un imunomodulator care îmbunătățește funcția imună a celulelor B, macrofage și natural killer [8]. Administrarea orală a fragmentelor de pectină solubilă inhibă creșterea și metastazarea tumorilor transplantate la șoareci [9, 10] și s-a demonstrat că pectina citrică modificată inhibă creșterea cancerului de colon și metastazele hepatice [11]. Cu toate acestea, mecanismele prin care pectina modificată exercită aceste efecte nu sunt cunoscute.

Scopul acestui studiu este de a caracteriza efectele citotoxice ale pectinei citrice fragmentate termic (HFCP) asupra a două linii de celule tumorale: celule HepG2 de hepatocarcinom uman și celule A549 de carcinom pulmonar uman. Raportăm că pectina citrică fragmentată termic induce o moarte celulară asemănătoare apoptozei, care este parțial independentă de caspază și activează autofagia în aceste două linii celulare.

Mergi la:

MATERIALE ȘI METODE

Fracționarea pectinei citrice prin tratament termic

Pectina citrică fragmentată termic (HFCP) a fost obținută conform metodei descrise de Jackson și colab. [7]. O soluție de 0,1% pectină citrică (Sigma P9135, în principal compusă din acid homopoligalacturonic) în apă dublu distilată a fost încălzită timp de 60 min la 123 °C și sub o presiune de 17,2-21,7 psi. Soluția a fost apoi înghețată la -80 °C și liofilizată. Materialul uscat a fost depozitat la 4 °C. Soluțiile proaspete în mediul de cultură s-au preparat chiar înainte de a fi adăugate la celule pentru incubări.

Cultura celulară și incubarea cu pectină

Celulele HepG2, A549, MCF-7 și MCF10A au fost obținute din American Type Culture Collection HepG2 cells; celulele MCF-7 au fost cultivate în mediu DMEM (Gibco 31825-023) și celulele A549 în mediu MEM (Gibco 41090-028). Pentru cultura de rutină, mediile au fost suplimentate cu 10% ser fetal bovin (Gibco 10270), iar celulele au fost menținute la 37 °C într-o atmosferă de 95% aer și 5% CO2. Celulele MCF10A au fost cultivate în mediu DMEM/F12 (Gibco 11320-074) conținând 5% ser de cal (Gibco 16050-122), 20 μg/ml EGF, 0,5 μg/ml hidrocortizon, 10 μg/ml insulină și 100 ng/toxină holerică. Pentru tratament, celulele au fost lăsate să adere timp de 24 de ore după însămânțare. Mediul a fost îndepărtat și celulele au fost spălate de două ori cu PBS (Lonza BE17-516F) și plasate într-un mediu fără ser conținând următoarele: 3 mg/ml HFCP sterilizat prin filtrare, 3 mg/ml pectină citrică sterilizată prin filtrare 3 mg/ml sau 50 pM etopozidă, utilizată ca martor pozitiv. Martorii negativi au fost celule incubate numai în mediu. În unele experimente, în acelați timp cu etopozida, HFCP sau pectina, când s-a indicat, s-au adăugat staurosporină (Sigma S4400), inhibitor pan-caspazic Z-VAD-fmk (BD Pharmingen 550377), 3-metiladenină (Sigma M9281) sau bafilomicină (Sigma B1793).

Testul viabilității celulare

Celulele HepG2 au fost însămânțate la 50.000 celule/godeu și celulele A549 la 30.000 celule/godeu în plăci cu 24 de godeuri înainte de tratamente timp de 6, 24 sau 48 de ore. S-a preparat soluție de bromură de MTT (bromură de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazoliu, Sigma M2128) la o concentrație de 2,5 mg/ml în soluție salină tamponată cu fosfat și o cantitate de 500 μl s-a adăugat în fiecare godeu. După 2 ore la 37 °C și atmosferă de 5% CO2, mediul și soluția MTT au fost îndepărtate înainte de a adăuga soluție tampon de lizare. Densitatea optică a fost măsurată o oră mai târziu la 570 nm folosind un spectrofotometru cu microplăci (spectrofotometru cu microplăci Bio-Rad x Mark) și software-ul Microplate manager 6.

Testul citotoxicității celulare

Celulele HepG2 au fost însămânțate la 50.000 celule/godeu și celulele A549 la 30.000 celule/godeu în plăci cu 24 de godeuri înainte de incubare timp de 24 sau 48 de ore. Pentru fiecare godeu, activitatea lactat dehidrogenazei a fost măsurată în supernatant, în celule detașate și în celule aderente după liza în PBS conținând 10% Triton X-100 (Merck 9036-19-5). Activitatea lactat dehidrogenazei a fost detectată printr-o analiză colorimetrică utilizând un kit de citotoxicitate (Roche 11644 793 001) și un spectrofotometru cu microplăci. Valorile citotoxicității s-au calculat prin raportul dintre cantitatea de LDH prezentă în supernatant și în celulele detașate din cantitatea totală de LDH, folosind următoarea formulă: 100 * (a+b)/(a ​​+ b+c), unde a = supernatant LDH; b = celule detașate LDH; c = celule aderente LDH.

Testarea fragmentării ADN

Celulele HepG2 au fost însămânțate la 50.000 celule/godeu și celulele A549 la 30.000 celule/godeu în plăci cu 24 de godeuri înainte de incubare timp de 6, 24 sau 48 de ore. A fost efectuat un test ELISA de detecție a deceselor celulare (Roche 11 544 675 001) conform instrucțiunilor producătorului. Absorbanța a fost măsurată utilizând un spectrofotometru la 405 nm. A fost efectuată normalizarea pentru conținutul de proteine ​​din plăcile surori, determinată folosind reactivul Pierce.

Activitatea caspazei-3

Celulele HepG2 și A549 au fost însămânțate la 600.000 celule/godeu în plăci cu 6 godeuri înainte de tratamente timp de 24 sau 48 de ore. Celulele au fost recoltate pe gheață în PBS și centrifugate la 4 °C la 1000 x g timp de 5 minute. Peletele celulare au fost omogenizate în soluție tampon de liză timp de 15 minute la 4 °C, iar proteinele solubile au fost colectate prin centrifugare la 4 °C. S-au preparat probe pentru a obține 20 μg de proteine ​​în 100 μl de apă distilată, la care s-au adăugat 50 μl de soluție tampon de reacție și 1 μl de substrat Ac-DEVD-AFC. Probele au fost incubate la 37 °C timp de 60 de minute, iar fluorescența a fost detectată la 505 nm după excitare la 400 nm utilizând un Fluoroscan. Analiza activității caspazei-3 a fost efectuată în conformitate cu Cosse și colab. [12].

Analiza Western blot

Lizatele celulare au fost preparate în soluție tampon de liză (40 mM Tris, pH 7,5, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100), care conține un cocktail inhibitor de protează (Complete de la Roche Molecular Biochemicals, 1 comprimat în 2 ml de H2O, adăugat la un raport de diluție 1:25) și o soluție tampon inhibitoare a fosfatazei (25 mM NAVO3, 250 mM PNPP, 250 mM α-glicerofosfat și 125 mM NaF, la un raport de diluție 1:25) în conformitate cu Cosse și colab. [12]. Mediul a fost centrifugat și celule granulate au fost adăugate la celulele lizate. Lizatele au fost apoi centrifugate la 12.000 x g timp de 5 minute și supernatanții au fost colectați. Proteinele (15 μg) au fost denaturate prin adăugarea de soluție tampon de probă LDS (Invitrogen NP0007) și încălzite la 70 °C timp de 10 minute. Proteinele s-au transformat într-un gel NuPAGE (Invitrogen) 4-12% și s-au transferat pe o membrană cu fluorescență scăzută (Millipore IPFL00010). Membranele au fost ținute timp de 1 oră în soluție de blocare LiCor și sondate peste noapte fie cu un anticorp anti-caspază-3 de iepure (Cell Signaling #9662S) care recunoaște formele de caspază-3 cu lungime întreagă și scindată la o diluție de 1/500, un anticorp anti-PARP de șoarece (BD Biosciences # 551024) la o diluție de 1/1000, anticorp anti-caspază-8 de șoarece (Cell Signaling #97465) la o diluție de 1/1000, un anticorp anti-ubiquitină de șoarece (LifeSensor VU101) la o diluție de 1/1000, un anticorp anti-LC3 de șoarece (NanoTools 0260-100/LC3-2G6) la o diluție de 1/600 sau un anticorp anti-p62 de șoarece (AB Nova # H00008878-M03) la o diluție de 1/500. Un anticorp anti-β-actină de șoarece (Sigma T5168) a fost utilizat la o diluție de 1/30.000 pentru imunodetecția β-actinei ca un martor de încărcare. Toți anticorpii au fost diluați în soluție LiCor conținând 0,1% Tween 20 (Sigma P1379). Membranele au fost clătite cu PBS+0,1% Tween 20 și incubate cu anticorpi anti-șoarece sau anti-iepure conjugați cu fluorocrom (BD Bioscience # 926-32221) la o diluție de 1/10.000 timp de 1 oră la întuneric la temperatura camerei. Pentru etichetarea anti-ubiquitină, membranele au fost spălate în PBS după transfer, fixate în PBS conținând 0,5% glutaraldehidă (pH 7) și clătite de trei ori în PBS înainte de blocare. Membranele au fost clătite încă o dată cu PBS+0,1% Tween 20 și uscate înainte de a fi scanate și analizate folosind software-ul Odyssey.

Marcarea prin imunofluorescență

Celulele HepG2 au fost însămânțate la 50.000 celule/godeu și celulele A549 la 30.000 celule/godeu în plăci cu 24 de godeuri 24 ore înainte de incubarea cu HFCP, pectină sau etopozidă timp de 24 ore. După incubare, celulele au fost fixate și permeabilizate timp de 10 minute cu o soluție rece de 80% metanol și 20% acetonă, spălate de trei ori cu PBS-2% BSA și incubate timp de 2 ore cu anticorpi primari. Anticorpul primar pentru colorarea LC3 a fost anti-LC3 de iepure (L7543 Sigma) (diluție 1/250), iar anticorpul primar pentru colorarea cu LAMP1 a fost anti-LAMP1 de șoarece (H4A3 primit de la August & Hildreth, Baltimore [13]). Celulele au fost spălate de trei ori cu PBS-2% BSA și apoi incubate timp de o oră cu anticorpii secundari. Anticorpul anti-IgG de iepure conjugat cu Alexa Fluor-488 și anticorpul anti-IgG de șoarece conjugat cu Alexa Fluor-568 (Molecular Probes) au fost utilizați la diluția 1/1000. După 1 oră de incubare, celulele au fost clătite de trei ori cu PBS. Pentru marcarea nucleară, celulele au fost incubate timp de 30 min cu TOPRO-3 (Molecular Probes, dil. 1/80) în prezența ARNzei de 2 mg/ml și apoi clătite de trei ori cu PBS. În cele din urmă, capacele au fost montate utilizând Mowiol (Sigma, St Louis, SUA), iar celulele au fost observate cu un microscop confocal fluorescent (Leica SP5).

Mergi la:

Rezultate

Pectina citrică fragmentată termic induce moartea celulelor HepG2 și A549

Pentru a studia efectele de inducere a morții celulare ale HFCP, două linii de celule canceroase, celule HepG2 și A549, au fost expuse pentru diferite perioade la HFCP. Concentrația de 3 mg/ml a fost aleasă după testarea mai multor concentrații de HFCP pe ambele tipuri de celule timp de 24 de ore (Fig. S1). Etopozida la o concentrație de 50 μM a fost utilizată ca un martor pozitiv. Morfologia celulelor analizate utilizând microscopia cu contrast în fază a arătat că etopozida induce o ușoară mortalitate în celulele A549, în timp ce celulele HepG2 par a fi mai sensibile la acest medicament. În plus, moartea celulelor a crescut cu timpul de incubare. HFCP la o concentrație de 3 mg/ml a determinat, de asemenea, moartea celulelor în ambele tipuri de celule, dar într-o măsură mult mai mare decât etopozida la o concentrație de 50 μM; efectul său a fost, de asemenea, dependent de timp. În schimb, pectina nemodificată la o concentrație de 3 mg/ml nu a afectat morfologia celulară (Fig. S2).

Analizele MTT s-au efectuat după 24 și 48 de ore (Fig.1A și 1B). Rezultatele au arătat că HFCP a scăzut viabilitatea celulelor HepG2 și A549 la ambii timpi de incubație, în timp ce pectina citrică nemodificată nu a făcut-o. Toxicitatea HFCP a crescut cu timpul de incubare și a fost mai severă decât cea indusă de etopozidă, în special pentru celulele HepG2. Pentru a confirma aceste date, eliberarea LDH a fost testată după 24 și 48 de ore (Fig. 1C și 1D), iar rezultatele au confirmat efectul citotoxic al HFCP asupra celulelor HepG2 și A549, cu un efect mai puternic asupra acestora.

Viabilitatea celulară (%) / Citotoxicitatea (%)

Pectină

 

Fig 1

HFCP induce moartea celulelor HepG2 și A549.

Pentru a investiga dacă serul poate fi protector împotriva acestei citotoxicități induse de HFCP, așa cum s-a observat pentru alți inductori de apoptoză cum ar fi etopozida, celulele HepG2 au fost incubate 24 de ore în prezența HFCP într-un mediu suplimentat cu 10% ser fetal de vițel. Staurosporina a fost utilizată ca martor pozitiv, deoarece efectul său apoptotic nu este inhibat de ser. Cu toate acestea, efectul citotoxic al HFCP nu a fost inhibat deloc de ser în aceste condiții (Fig. S3). De asemenea, au fost realizate experimente cu concentrații mai scăzute pentru un timp de incubare mai lung (72 de ore) utilizând celule HepG2. Acestea s-au efectuat cu și fără ser. În comparație cu 24 de ore de incubare, 1 mg/ml HFCP a indus o scădere mai importantă a numărului de celule viabile după 72 de ore de incubare. Serul a părut a fi ușor protector după 72 de ore de incubare, ceea ce nu a fost cazul după 24 de ore de incubare (Fig. S4).

Efectul HFCP a fost, de asemenea, testat pe celule normale. Aceasta s-a efectuat cu concentrații mari pentru un timp de incubare scurt (24 de ore), precum și cu concentrații scăzute pentru un timp de incubare lung (72 de ore), cu și fără ser. Pentru aceste experimente au fost utilizate celule MCF-10A. Celulele MCF10A sunt o linie de celule epiteliale imortalizate, netransformate, derivate din țesuturi mamare fibrochistice umane. Acestea sunt adesea considerate ca un martor normal pentru celulele canceroase. Rezultatele au arătat că HFCP a indus, de asemenea, un efect citotoxic puternic în aceste celule. Aceste rezultate indică faptul că HFCP probabil nu este specific pentru celulele canceroase (Fig. S5). Trebuie remarcat faptul că etopozida și staurosporina au fost la fel de toxice pentru celulele MCF10A ca și pentru celulele HepG2, în timp ce etopozida este în prezent utilizată în clinici pentru a trata mai multe tipuri de cancer.

Pectina citrică fragmentată induce apoptoza non-canonică în HepG2 și A549

Pentru a investiga dacă fragmentele de pectină induc apoptoza, am analizat activarea caspazei-3 printr-o analiză Western blot. Activarea caspazei-3 a avut loc prin scindare, rezultând fragmente de 14 kDa și 17 kDa, așa cum s-a observat atunci când celulele au fost incubate cu etopozidă timp de 24 sau 48 h (Fig. 2A). Celulele HepG2 incubate timp de 24 sau 48 de ore cu HFCP au prezentat diferite forme de caspază-3 scindată comparativ cu celulele incubate cu etopozidă. La 24 de ore, au apărut benzi suplimentare cu mase moleculare aparente mai mari, aproximativ 20 și 60 kDa; la 48 ore, fragmentele scindate ale caspazei-3 au fost mai puțin abundente în celulele incubate cu HFCP, dar forma de caspază-3 de 60 kDa a fost încă prezentă (Fig. 2A). După 48 de ore de incubare, un fragment de 20 kDa a apărut în celule expuse numai la mediu, etopozidă și pectină nefragmentată, cel mai probabil deoarece aceste celule au fost incubate fără ser. Cu toate acestea, banda de 60 kDa a fost specifică celulelor incubate cu HFCP.

PARP scindat

Activitatea caspazei (RFU)

Absorbanța/Concentrația proteică

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 2

HFCP induce apoptoza în celulele HepG2 și A549.

De asemenea, s-au observat scindarea caspazei și benzi suplimentare în celulele A549 după 24 sau 48 de ore de tratament HFCP (Fig. 2B). În plus, modelul de scindare a caspazei-3 în celulele A549 incubate cu HFCP a prezentat un frotiu ciudat de la 30 la 60 kDa (Fig. 2B). O analiză Western blot pentru proteina PARP (Fig. 2A și 2B), un substrat al caspazei-3, a arătat scindarea acestei proteine ​​în ambele tipuri de celule incubate cu HFCP sau etopozidă pentru ambele perioade. Scindarea PARP a fost, de asemenea, detectată în celule HepG2 incubate timp de 48 de ore cu un singur mediu sau cu o pectină nemodificată, în timp ce PARP scindat a fost mai puțin abundent în aceste celule decât în ​​celulele incubate cu HFCP. Celulele A549 incubate timp de 24 sau 48 de ore cu pectină nemodificată au prezentat o cantitate abia detectabilă de PARP scindată, cel mai probabil deoarece incubarea a fost în mediu fără ser.

Pentru a determina dacă scindarea neconvențională a caspazei-3 a condus la activarea enzimei, activitatea caspazei-3 a fost testată în celule HepG2 și A549 incubate cu 50 μM etopozidă, 3 mg/ml HFCP sau 3 mg/ml pectină pentru 8, 24 și 48 h (Fig. 2C și 2D). Rezultatele au arătat că, după 24 de ore de incubare, etopozida a crescut puternic activitatea caspazei-3 în celulele HepG2 în comparație cu celulele martor. Celulele HepG2 tratate cu HFCP au prezentat, de asemenea, o activitate mai mare a caspazei-3 care a crescut cu timpul de incubare. Celulele A549 tratate cu etopozidă au prezentat o creștere redusă a activității caspazei-3 în comparație cu celulele martor; deși această creștere a activității caspazei-3 a fost mai puțin importantă decât cea observată la celulele HepG2, dar a fost totuși semnificativă din punct de vedere statistic. Celulele A549 expuse la HFCP au prezentat de asemenea activarea caspazei-3 care a crescut în timp.

Pentru a confirma că HFCP induce apoptoza, a fost evaluată fragmentarea ADN-ului, o caracteristică târzie a apoptozei. Pentru măsurarea eliberării nucleozomilor liberi din ADN (Fig. 2E și F) s-a folosit un kit ELISA pentru nucleozomi liberi și rezultatele au arătat că celulele HepG2 și A549 tratate cu etopozidă au prezentat fragmentarea ADN conducând la eliberarea de nucleozomi. În contrast cu ceea ce s-a observat pentru etopozidă, fragmentarea ADN nu a fost observată în celulele incubate cu HFCP, ceea ce indică faptul că celulele HepG2 și A549 tratate cu pectină fragmentată nu prezintă caracteristici apoptotice clasice. Acest lucru este în concordanță cu morfologia nucleară observată după colorarea DAPI, care nu a prezentat caracteristici fragmentare apoptotice fragmentate, dar părea că este înrăutățită.

De asemenea, a fost efectuat un test de viabilitate în celulele MCF7 cu deficit de caspază-3 (Fig. S6). Rezultatele au arătat o scădere a viabilității acestor celule atunci când au fost incubate în prezența HFCP timp de 24 sau 48 de ore, sugerând că activarea caspazei-3 nu este necesară pentru inducerea morții celulare ca răspuns la expunerea la HFCP.

Rolul caspazelor în moartea celulară indusă de HFCP

Pentru a investiga rolul caspazelor în moartea celulară indusă de HFCP, celulele au fost incubate cu HFCP în prezența unui inhibitor de pan-caspază (Z-VAD-fmk) și viabilitatea și citotoxicitatea celulelor HepG2 și A549 după 24 ore au fost analizate. Inhibitorul de caspază a condus la o creștere ușoară a viabilității în ambele tipuri de celule incubate cu etopozidă (Fig. 3A și 3B), o scădere ușoară a citotoxicității în celulele HepG2 incubate cu etopozidă și o scădere marcată a citotoxicității în celulele A549 incubate cu etopozidă (Fig. 3C și 3D). Acest set de date sugerează că Z-VAD-fmk a fost capabil să prevină, cel puțin parțial, moartea celulară asociată cu activitatea caspazei. Cu toate acestea, celulele HepG2 incubate cu HFCP în prezența Z-VAD-fmk nu au prezentat nicio creștere a viabilității în comparație cu celulele incubate numai cu HFCP. Un test de citotoxicitate a confirmat aceste observații (Fig.3A și 3C), indicând astfel absența contribuției caspazelor la moartea celulelor HepG2 indusă de HFCP. Cu toate acestea, celulele A549 incubate cu HFCP și inhibitor de caspază au prezentat o viabilitate mai mare și mult mai puțină citotoxicitate decât celulele A459 incubate numai cu HFCP, sugerând că acestea (caspazele) pot fi implicate în moartea indusă de HFCP în celulele A549 (Fig. 3B și 3D).

Viabilitate (%) / Citotoxicitate (%) / PARP scindat

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 3

Apoptoza indusă de HFCP este parțial inhibată de inhibarea caspazei.

Într-o încercare de a înțelege efectul diferențial al inhibitorului caspazei asupra acestor două tipuri de celule, am verificat dacă Z-VAD-fmk a inhibat activitatea caspazei la concentrația utilizată în această lucrare (Tabelul S1). Într-adevăr, rezultatele au arătat că Z-VAD-fmk a inhibat complet activarea caspazei indusă de etopozidă și HFCP. Apoi am analizat scindarea caspazei-3 și scindarea PARP în absența sau în prezența Z-VAD-fmk prin Western blot (Fig. 3E și 3F). Fragmentarea caspazei-3 care a fost observată atunci când celulele au fost expuse la etopozidă nu a mai fost observată când a fost adăugat Z-VAD-fmk, rezultat care este în concordanță cu literatura de specialitate [14]. Fragmentarea non-canonică a caspazei-3 care a fost observată atunci când celulele HepG2 și A549 au fost tratate cu HFCP a fost, de asemenea, inhibată și modelul de scindare a caspazei-3 a devenit comparabil cu cel observat pentru celulele expuse la etopozidă în prezența Z-VAD-fmk, cu excepția benzii de 60 kDa care a fost încă detectată în ambele tipuri de celule incubate cu HFCP și Z-VAD-fmk.

Aceste date ridică posibilitatea ca scindarea „neconvențională” a caspazei-3 observată să se datoreze altor caspaze sau proteaze și astfel ar putea să nu fie legată de apoptoza clasică. Într-adevăr, scindarea proteinei PARP indusă de HFCP a fost doar parțial inhibată de Z-VAD-fmk, indicând faptul că un alt mecanism decât activarea caspazei ar putea fi implicat. În plus, scindarea proteinei PARP indusă de etopozidă nu a fost inhibată de Z-VAD-fmk în celulele A549, în timp ce scindarea proteinei PARP indusă prin tratamentul cu HFCP a fost complet inhibată.

Deoarece caspazele efectoare sunt activate de caspazele inițiatoare, scindarea caspazei-8 a fost analizată în celule HepG2 printr-o analiză Western blot (Fig. 4A). Rezultatul a arătat că incubarea celulelor HepG2 în prezența etopozidei sau HFCP a generat fragmente scindate de caspază-8 cu o greutate moleculară de 43 și 41 kDa (Fig. 4A). Scindarea caspazei-8 în celulele expuse la etopozidă este în concordanță cu datele din literatura de specialitate [15], iar această scindare a fost împiedicată de prezența Z-VAD-fmk atât în celule expuse la etopozidă cât și la HFCP (Fig. 4A). În plus, abundența procaspazelor cu lungime întreagă a scăzut în celulele HepG2 incubate cu HFCP și nu a fost prevenită prin adăugarea de Z-VAD-fmk. Prin urmare, scăderea abundenței procaspazei-8 nu s-a datorat scindării cauzate de alte caspaze deoarece Z-VAD-fmk nu a împiedicat-o.

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 4

HFCP induce scindarea caspazei-8 și α-fodrinei.

Calpainele sunt proteaze care sunt de asemenea activate ca răspuns la stres și pot participa la moartea celulelor. Deoarece studiul modelului de scindare a α-fodrinei ar putea informa asupra activării caspazei sau calpainei [16, 17], fragmentarea α-fodrinei a fost evaluată printr-o analiză Western blot în celulele HepG2 și A549 după 6 și 24 de ore de incubare cu sau cu adăugarea de Z-VAD-fmk pentru a determina activarea calpainelor în timpul morții celulare induse de HFCP (Fig. 4 C, D). Modelul de scindare teoretică a α-fodrinei este prezentat în Fig. 4B. α-fodrina cu lungime întreagă are o greutate moleculară de 280 kDa; α-fodrina scindată de caspază prezintă benzi de 150 și 120 kDa și α-fodrina scindată de calpaină prezintă benzi de 150 și 145 kDa. În ambele tipuri de celule expuse la etopozidă sau HFCP (Fig. 4C și D), a fost detectată forma de lungime completă a proteinei, fiind un fragment de 150 kDa. Acest fragment ar putea reprezenta scindarea α-fodrinei la un situs hipersensibil prin niveluri scăzute de proteaze active endogen [18]. După 24 de ore de incubare, modelul de scindare α-fodrină în celulele incubate cu HFCP a fost similar cu modelul de scindare în celulele incubate cu etopozidă și ambele au prezentat un fragment de 120 kDa. Deoarece produsul α-fodrină de 120 kDa este asociat cu activarea caspazei-3 [19] și formarea acestui fragment a fost inhibată atunci când s-a adăugat Z-VAD-fmk în ambele cazuri, rezultatele indică faptul că HFCP a indus activarea unor caspaze în ambele tipuri de celule.

S-a demonstrat că activarea caspazei 8 este indusă într-o manieră independentă de receptor ca urmare a inhibării proteazomilor [20]. Deoarece niciun receptor nu a fost încă raportat pentru HFCP și pentru a investiga dacă HFCP ar putea activa o astfel de cale, ubiquitinizarea proteinei a fost evaluată printr-o analiză Western blot în celulele HepG2 și A549. O creștere precoce a ubiquitinizării a fost observată atunci când celulele au fost incubate în prezența HFCP timp de 6 ore, dar nu în prezența doar a mediului, etopozidei sau pectinei nemodificate, care a fost încă detectabilă după 24 de ore de la incubare (Fig. 5A și B).

 

Fig 5

HFCP induce ubiquitinizarea proteinelor.

Incubarea HFCP induce activarea autofagă în celulele HepG2 și A549

Apoptoza nu mai este considerată ca singurul tip de moarte celulară programată (PCD), iar autofagia este acum acceptată ca un alt tip de PCD [21].

Deoarece datele noastre sugerează că apoptoza ar putea să nu fie, sau ar pute fi doar parțial, mecanismul responsabil pentru moartea celulară indusă de HFCP, am investigat dacă HFCP ar putea induce autofagia prin analize Western blot pentru proteinele LC3 și p62. O creștere a abundenței LC3II și degradarea p62 sunt, de obicei, corelate cu activarea autofagiei [22].

Celulele HepG2 incubate cu HFCP timp de 24 de ore au prezentat o ușoară conversie a LC3I în LC3II; totuși, acest efect a fost mai mic decât cel indus de etopozidă (Fig. 6A). În plus, abundența p62 a scăzut atunci când celulele HepG2 au fost expuse la HFCP, dar nu la etopozidă (Fig. 6A). După 48 de ore de incubare, LC3II s-a acumulat, de asemenea, în celulele martor, cel mai probabil deoarece celulele au fost incubate fără ser. Acest efect a fost mai puțin pronunțat în prezența etopozidei sau HFCP.

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 6

HFCP induce autofagia în celulele HepG2 și A549.

Modelul LC3 a fost de asemenea evaluat prin marcare cu imunofluorescență. Un model punctat al LC3 a fost observat în celulele HepG2 incubate cu etopozidă sau HFCP (Fig. 6C). Cu toate acestea, s-a observat doar colocalizarea minimă a LC3 de la autofagozomi și LAMP1 de la lizozomi, atât în ​​celule incubate cu etopozidă cât și în celule incubate cu HFCP.

După 24 de ore de incubare, abundența LC3II a crescut în celulele A549 incubate cu etopozidă și pectină, dar nu și în celulele incubate cu HFCP (Fig. 6B), în timp ce abundența P62 a scăzut totuși în celulele incubate cu HFCP. În plus, o incubare de 48 de ore a condus la acumularea de LC3II în celulele tratate cu etopozidă și HFCP. În mod surprinzător, forma LC3I nu a putut fi detectată prin Western blot pentru celulele A549 și abundența proteinei p62 a scăzut în celulele A549 incubate cu HFCP după 24 și 48 de ore. Cu toate acestea, inducerea autofagiei pare să fie mai puțin importantă în celulele A549 comparativ cu celulele HepG2. Modelul de colorare LC3 observat prin microscopie confocală a fost în mod clar punctat în celulele A549 incubate cu HFCP timp de 24 de ore (Fig. 6D).

Pentru a examina apoptoza, am folosit inhibitori de autofagie pentru a evalua dacă autofagia ar putea fi implicată în moartea celulară indusă de HFCP. 3-metiladenina (3-MA) ​​a fost utilizată pentru a bloca formarea autofagozomilor prin inhibarea fosfatidilinozitol 3-kinazei tip III, iar bafilomicina a fost utilizată pentru a preveni maturarea vacuolului autofagic prin inhibarea fuziunii autofagozomului cu lizozomul [22]. Într-adevăr, bafilomicina este un inhibitor al H+-ATPazei (V-ATPază) de tip vacuolar, împiedicând astfel acidifierea organelelor care conțin această enzimă, cum ar fi lizozomii și endozomii. Conversia LC3II și abundența p62 în celulele HepG2 și A549 după incubare în prezența de 1 mM 3-MA au fost evaluate printr-o analiză Western blot și efectul acestor inhibitori asupra morții celulare induse de HFCP a fost evaluat prin testul MTT. Celulele HepG2 și A549 incubate cu 3-MA au prezentat o creștere redusă a abundenței p62 în celulele martor și celulele expuse la etopozidă, sugerând că autofagia 3-MA a inhibat parțial autofagia la concentrația utilizată. Totuși, nu a fost observat niciun efect al 3-MA asupra degradării p62 în celulele incubate HFCP (Fig. 7A, C). Incubarea cu 3-MA nu a avut niciun efect asupra conversiei LC3II în celule HepG2 incubate cu etopozidă, dar a crescut ușor cantitatea de LC3II în celulele martor și în celulele incubate cu pectină. În ceea ce privește celulele A549, nu a fost observat niciun efect al 3-MA asupra abundenței LC3II, deși o ușoară creștere a nivelului p62 a fost observată atât în ​​celulele controlate cât și în cele expuse la etopozidă.

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 7

Inhibarea autofagiei folosind 3-MA.

Viabilitatea celulelor HepG2 și A549 a fost evaluată după 24 și 48 de ore de incubare cu sau fără 1 mM 3-MA (Fig. 7B). 3-MA nu a afectat scăderea viabilității induse de HFCP în celulele HepG2 după 24 sau 48 de ore. În celulele A549, incubația 3-MA ca crescut ușor pierderea viabilității induse de HFCP(Fig. 7D), indicând faptul că HepG2 și A549 nu reacționează într-un mod diferit atunci când sunt expuse la HFCP și că autofagia ar putea proteja celulele A549 incubate în prezența pectinei fragmentate termic.

Când celulele au fost incubate în prezența a 100 nM bafilomicină timp de 24 de ore, a fost prevenită degradarea LC3II; într-adevăr, o acumulare a acestei proteine ​​a fost observată în celulele martor, precum și în celulele incubate cu etopozidă și pectină nemodificată. Totuși, nicio acumulare de LC3II nu a fost observată în niciuna dintre liniile celulare incubate cu HFCP (Fig. 8A, 8C). În plus, degradarea p62 care rezultă din expunerea la HFCP nu a fost inhibată, ceea ce indică faptul că degradarea p62 ar putea fi independentă de fuziunea autofagozomică cu lizozomi.

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 8

Inhibarea autofagiei folosind bafilomicină.

Incubarea cu bacilomicină 100 nM a afectat viabilitatea tuturor celulelor, cu excepția celor incubate cu HFCP, în concordanță cu analiza Western blot pentru LC3II. Astfel, celulele expuse la HFCP ar putea fi insensibile la bafilomicină (Fig. 8B, 8D).

Mergi la:

Discuție

Activitatea anticanceroasă a formelor modificate de pectină a fost raportată anterior pentru diferite linii celulare. Jackson și colab. au studiat efectul diferitelor forme de pectină asupra celulelor cancerului de prostată LNCaP [7], iar Yan și Katz au arătat că pectină citrică modificată PectaSol-C a indus apoptoza în celulele cancerului de prostată dependente și independente de androgeni de șoareci, cu scindarea caspazei-3 [23]. De asemenea, s-a raportat că incubarea celulelor melanom B16F10 cu RG-I din bame a redus proliferarea și a indus apoptoza [5]. În plus, GCS-100, o polizaharidă derivată din pectină de citrice, a indus apoptoza în celulele mielomului multiplu prin eliberarea citocromului c și prin activarea caspazei-3 [6]. Cu toate acestea, mecanismele care stau la baza activității apoptotice a pectinei modificate au rămas neclare și nu au fost bine definite.

În acest studiu, celulele HepG2 și A549 incubate cu HFCP au prezentat dovezi ale apoptozei. Scindarea PARP în fragmentul de 89 kDa este asociată cu inducerea apoptozei [24], precum și cu activarea caspazei-3 și -7. Deși PARP poate fi scindat de alte proteine ​​decât caspazele, proteazele precum calpaina sau catepsina dau naștere la un fragment de 40 kDa sau, respectiv, fragmente de 55 și 42 kDa, [25,26]. Astfel, este puțin probabil ca calpainele sau catepsinele să fie activate în celulele incubate cu HFCP, deoarece numai un fragment PARP de 89 kDa a fost observat. În plus, modelul de scindare a α-fodrinei sugerează că caspazele și nu calpainele sunt responsabile pentru scindarea sa în celulele expuse la etopozidă și HFCP ale ambelor tipuri de celule. O examinare a fragmentării caspazei-3 a evidențiat prezența fragmentelor corespunzătoare activării caspazei-3 în celulele incubate cu HFCP, chiar dacă au apărut benzi suplimentare necunoscute.

Cu toate acestea, nu au fost detectate toate caracteristicile tipice ale apoptozei. Într-adevăr, celulele HepG2 și A549 nu au prezentat fragmentarea ADN după incubarea cu HFCP, dar au arătat nuclee micșorate. Utilizarea inhibitorului pan-caspazic Z-VAD-fmk în celule HepG2 nu a împiedicat moartea celulelor induse de HFCP, dar a împiedicat scindarea caspazei-3 și a împiedicat parțial scindarea PARP, confirmând implicarea unor caspaze. O posibilă explicație a acestor discrepanțe aparente ar putea fi inhibarea caspazi-3 și activarea altei proteaze care împărtășește unele substraturi de caspază-3. Echipa lui Peltenburg a arătat că în celulele melanom incubate cu etopozidă, adăugarea de Z-VAD-fmk nu este capabilă să prevină scindarea PARP în ciuda inhibării activității DEVDazei. În plus, degradarea PARP și activarea caspazei au fost ambele inhibate în celule pretreate cu fluorură de 4-(2-aminoetil) benzensulfonil (AEBSF), un inhibitor de serin protează. Acești autori au concluzionat că o serin protează reglează un mecanism alternativ de inițiere care conduce la activarea caspazei și la scindarea PARP în ciuda prezenței Z-VAD-fmk [27]. Un astfel de mecanism ar putea explica datele paradoxale pe care le-am obținut și ar putea explica de asemenea scindarea PARP observată în celulele A549 incubate timp de 48 de ore în prezența etopozidului și Z-VAD-fmk.

Analizele Western blot ale caspazei-3 au arătat un model non-canonic al scindării caspazei-3 și apariția benzilor cu greutăți moleculare mai mari decât cele așteptate (în principal la 20 kDa și 60 kDa și un frotiu, în majoritate în celulele A549, între 30 și 60 kDa). Această modificare a mobilității electroforetice nu se datorează fosforilării, deoarece tratamentul cu α-fosfatază al eșantionului nu a afectat-o ​​(datele nu sunt prezentate). Susuki și colab. au sugerat posibilitatea degradării caspazei-3 active de proteazom după ubiquitinizare prin XIAP [28], iar un studiu realizat de Ares și colab. a sugerat că incubarea celulelor HMEC-1 cu oxLDL conduce la poliubiquitinizarea caspazei-3 și inactivarea acestei proteaze. În celulele HepG2 și A549 incubate în prezența HFCP, am găsit o creștere a ubiquitinizării proteinelor. Ubiquitinizarea caspazei-3 ar putea explica profilul migrațional neobișnuit al acestei proteine ​​în analiza Western blot. O posibilă explicație a activității caspazei-3 detectată în celulele tratate cu HFCP este coexistența caspazei-3 activă și caspazei-3 modificate pe durata acestui timp de incubare. Modelul Western blot ar putea reprezenta o suprapunere a tiparelor pentru două populații de caspază-3.

Inhibarea caspazelor cu Z-VAD-fmk în celulele HepG2 și A549 a împiedicat scindarea PARP și a caspazei, indicând faptul că, deși aceste scindări sunt non-canonice, ele pot depinde de unele caspaze. Deoarece a fost observată activarea caspazei-8, această protează poate fi implicată. S-a demonstrat posibilitatea activării caspazei-8 prin autofagie după inhibarea proteazomilor [29]. În această situație, activitatea caspazei-8 este scăzută și persistă mult timp. Caspaza-8 posedă activitate DEVDază [30], iar proteina PARP este scindată la un sit DEVD [31]. Cu toate acestea, inhibarea caspazei nu a influențat citotoxicitatea HFCP indusă în celulele HepG2 și a redus-o ușor în celulele A549 la un moment dat târziu, ceea ce indică faptul că, caspazele nu sunt necesare pentru moartea celulară indusă de HFCP. Aceste rezultate confirmă faptul că HFCP nu a induce apoptoza clasică, ci mai degrabă o formă de moarte celulară care nu necesită activarea caspazei-3. În plus, incubarea cu HCFP a celulelor MCF7, care sunt deficitare pentru caspaza-3, a arătat o scădere a viabilității, confirmând că, caspaza-3 nu este esențială pentru debutul morții celulare induse de HFCP.

Se crede că autofagia are un rol dublu în moartea celulară (promovare sau protecție) și este acceptată ca un al doilea tip de moarte celulară programată în anumite circumstanțe [32, 33]. Markerii autofagiei ar putea fi detectați în ambele tipuri de celule incubate în prezența HFCP.

Scăderea abundenței p62 observată în analiza Western blot și modelul punctual marcat observat pentru colorația LC3 sugerează că HFCP a indus activarea precoce a autofagiei. Din cunoștințele noastre, aceasta este prima dată când activarea autofagiei este prezentată în celulele canceroase tratate cu pectină modificată. În celulele HepG2 incubate în prezența HFCP timp de 24 ore, a fost observată o creștere a abundenței LC3II în comparație cu celulele martor. Aceasta indică o creștere a formării autofagozomilor. După 48 de ore de incubare fără ser, abundența LC3II a crescut în celulele HepG2 incubate în condiții diferite, cu excepția celulelor incubate cu HFCP. Acest rezultat ar putea fi datorat inhibării autofagiei sau unei rate mai mari de degradare autofagică în celulele HFCP decât în ​​celulele martor [34]. Incubarea celulelor HepG2 cu 3-MA nu a modificat semnificativ abundența LC3II sau nu a influențat viabilitatea celulelor. Cu toate acestea, nu putem exclude complet faptul că o concentrație de 3 MA utilizată (1 mM) a fost prea mică. Deoarece concentrația recomandată de 5 mM a fost toxică pentru celulele HepG2 în condițiile experimentale, o concentrație mai mare de 3-MA ar fi avut un impact mai important asupra celulelor HepG2 incubate cu HFCP. Spre deosebire de 3-MA, bafilomicina a avut un efect marcat asupra conversiei LC3II în celulele HepG2, dar este, de asemenea, toxică. Bafilomicina este un inhibitor al H+-ATPazei vacuolare (V-ATPază), indispensabilă pentru fuziunea autofagozomilor și lizozomilor și pentru maturarea ulterioară a autofagozomilor [35]. În celulele în care autofagia este afectată de bafilomicină, LC3II se asociază cu membrana interioară a autofagozomului și nu mai este degradată; astfel, poate fi observată o creștere a abundenței LC3II [34]. Acest lucru a fost găsit în celulele martor HepG2 și celulele HepG2 incubate în prezența etopozidei sau a pectinei nemodificate. Într-adevăr, abundența LC3II a crescut în prezența bafilomicinei, indicând faptul că în aceste celule a apărut autofagia și această inducere a autofagiei este consecventă cu o perioadă de incubație de 24 de ore fără ser. În mod surprinzător, celulele HepG2 incubate în prezența HFCP nu au prezentat o creștere a LC3II când a fost adăugat bafilomicina. Aceste rezultate ar putea sugera că fluxul autofagiei a fost blocat în celulele HepG2 expuse la HFCP sau că bafilomicina nu a fost eficientă în aceste celule tratate. Proteina p62 este cunoscută ca o proteină adaptor în autofagia selectivă, interacționând cu semnalul ubiquitinei pe agregatele proteice și ca o componentă autofagică cu LC3 prin motivul LIR, permițând formarea autofagozomului pentru a înghiți agregatele (revizuit în [36]). Autofagia cu deficiențe nu trebuie să determine degradarea proteinei p62. În plus, p62 este, de asemenea, cunoscut ca un factor de navetă pentru furnizarea substraturilor poliubiquitinizate la proteazomi, iar o scădere a nivelurilor p62 conduce la o acumulare de proteine ​​ubiquitinizate [37]. Scăderea abundenței p62 observată în celulele HepG2 incubate cu HFCP ar putea explica augmentarea ubiquitinizării observate în aceste celule tratate.

Abundența LC3II a crescut în celulele A549 incubate în prezența HFCP numai după 48 de ore de incubare, în ciuda scăderii abundenței p62 și a punctuării LC3II. Este important de menționat că volumul de LC3II poate fluctua foarte mult în timp și că abundența p62 ar putea scădea chiar dacă nu există acumulare abundentă de LC3II [34]. 3-MA a scăzut viabilitatea celulelor A549 incubate cu HFCP, sugerând că autofagia indusă de HFCP ar putea avea un rol protector în celulele A549. Incubarea celulelor A549 cu bafilomicină a diminuat viabilitatea, cu excepția celulelor incubate HFCP la 24 și 48 de ore, iar Western blot nu a evidențiat o creștere a abundenței LC3II, sugerând că autofagia a fost blocată în celulele A549 expuse la HFCP sau că bafilomicina nu a fost eficientă în celule incubate cu HFCP, cum ar fi celulele HepG2.

Luate împreună, aceste rezultate sugerează mai multe ipoteze posibile pentru a explica modul în care HFCP induce moartea celulelor. Prima ipoteză ar fi o cale clasică de apoptoză. Moleculele HFCP se pot lega de un receptor de omorâre pe suprafața celulară, inducând activarea caspazei-8 inițiatoare. Caspaza-8, la rândul său, va scinda și va activa caspaza-3 efectoare, care apoi își desprinde substraturile, inclusiv PARP și α-fodrină. În același timp, autofagia este indusă fie direct prin molecule HFCP, fie prin apoptoză. În celulele A549, această autofagie ar putea fi parțial protectoare. Totuși, acest model este prea simplu pentru a explica absența fragmentării ADN și nu poate explica amplificarea ubiquitinării observate în celulele tratate cu HFCP.

O a doua ipoteză ar putea fi faptul că incubarea celulelor cu HFCP a indus o acumulare de proteine ​​într-un număr necorespunzător, ceea ce a dus la ubiquitinizarea lor. Alternativ, dar nu exclusiv, HFCP ar putea conduce la inhibarea proteazomilor, prin urmare, la acumularea proteinelor ubiquitinizate (Fig. 9). Această acumulare poate activa apoptoza dependentă de caspază-3, așa cum s-a observat în mai multe tipuri de celule [38, 39]. Cu toate acestea, caspaza-3 poate fi de asemenea ubiquitinizată [39]; astfel, activitatea sa poate fi parțial inhibată. Acest lucru poate explica de ce am observat benzi moleculare înalte pentru caspaza-3 pe Western blot pentru celulele incubate cu HFCP. În plus, acumularea proteinelor ubiquitinizate în celulele cu inhibiție proteazomică activează calea de degradare a autofagiei, permițând celulei să reziste pentru un timp [40]. Cu toate acestea, deoarece homeostazia nu este restaurată, ea devine letală celulelor HepG2, în timp ce celulele A549 nu au nicio „sansă” în afară de a trece la apoptoză, probabil prin activarea caspazei-8 [29]. Astfel, presupunem că HFCP poate conduce la inhibarea proteazomilor, care inițiază autofagia ca mecanism compensator pentru a face față acumulării de proteine ​​ubiquitinizate, ceea ce duce la activarea caspazei-8 și la apoptoza atipică.

Pectină / căldură

Membrană plasmatică / Ubiquitinizare

PARP scindat / Casp-3 scindat / Casp-8 scindat

Proteazom

Caspază activă / Autofagie

Niciun efect / Bafilomicină

Moartea celulelor HepG2 indusă de HFCP / Moartea celulelor A549 indusă de HFCP

 

Deschide într-o fereastră separată

Fig 9

Reprezentarea schematică a posibilelor mecanisme de moarte celulară indusă de HFCP în celulele HepG2 și A549.

HFCP a exercitat efecte citotoxice asupra a două linii celulare de cancer diferite, dar și în celule MCF10A. Celulele MCF10A sunt o linie de celule epiteliale imortalizate, netransformate, derivate din țesuturi mamare fibrochistice umane. Acestea sunt adesea considerate ca un martor normal pentru celulele canceroase. Trebuie remarcat faptul că în condițiile culturii noastre, etopozida, un medicament chimioterapeutic utilizat în prezent în clinici pentru tratarea mai multor tipuri de cancer, a indus, de asemenea, o scădere semnificativă a viabilității MCF10A. Sunt, prin urmare, necesare mai multe investigații pentru a delimita dacă efectele citotoxice ale HFCP ar fi specifice celulelor canceroase sau nu.

Caracterizarea suplimentară a fragmentelor de pectină bioactivă și a răspunsurilor biologice asociate ar putea fi de mare interes. Deoarece unele tipuri de cancer prezintă rezistență la tratamentul chimioterapeutic, care induce apoptoza dependentă de caspază, un nou tratament terapeutic care promovează o cale de moarte celulară independentă de caspază ar putea spori eficiența tratamentelor actuale de cancer.

Mergi la:

INFORMAȚII JUSTIFICATIVE

Fig S1

Citotoxicitatea pectinei citrice modificată termic.

Celulele HepG2 și A549 au fost incubate doar cu mediu (Ctl-), 50 μM etopozidă (etop) sau pectină citrică hidrolizată la diferite concentrații. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul MTT după 24 de ore de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). *, ** sau ***: p < 0,05, p < 0,01 sau p < 0,001 utilizând ANOVA I și testul de comparație multiplu Tukey.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(66K, pdf)

Fig S2

Efectul pectinei citrice modificate teermic asupra morfologiei celulare.

Celulele HepG2 și A549 au fost incubate doar cu mediu (Ctl-), 50 μM etopozidă (etop), 3 mg/ml pectină citrică hidrolizată sau 3 mg/ml pectină pentru 24 și 48 de ore. Micrografe au fost luate în microscopie cu contrast de fază (obiectiv 20x) după 24 sau 48 de ore de incubare.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(2.1M, pdf)

Fig S3

Efectul serului asupra citotoxicității pectinelor citrice modificate termic.

Celulele HepG2 au fost incubate numai cu mediu (Ctl), 1 μM staurosporină (STS), 50 μM etopozidă (Etop), diferite concentrații de pectină citrică hidrolizată (HFCP) sau 3 mg/ml de pectină citrică (Pectină), cu (A) sau fără (B) 10% ser fetal de vițel. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul MTT după 24 de ore de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). ***: p < 0,001 utilizând ANOVA I și testul de comparație multiplu Tukey.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(78K, pdf)

Fig S4

Efectul citotoxic al pectinei citrice modificate termic la doze mici.

Celulele HepG2 au fost incubate numai cu mediu (Ctl), 1 μM staurosporină (STS), 50 μM etopozidă (Etop), diferite concentrații de pectină citrică hidrolizată (HFCP) sau 3 mg/ml de pectină citrică (Pectină), cu (A) sau fără (B) 10% ser fetal de vițel. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul MTT după 72 de ore de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). ***: p < 0,001 utilizând ANOVA I și testul de comparație multiplu Tukey.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(77K, pdf)

Fig S5

Efectul citotoxic al pectinei citrice modificate termic asupra celulelor MCF10A.

Celulele MCF10A au fost incubate numai cu mediu (Ctl), 1 μM staurosporină (STS), 50 μM etopozidă (Etop), diferite concentrații de pectină citrică hidrolizată (HFCP) sau 3 mg/ml de pectină citrică (Pectină), cu (A, B) sau fără (C, D) 10% ser fetal de vițel. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul MTT după 24 de ore (A, C) sau 72 de ore (B, D) de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). ***: p < 0,001 utilizând ANOVA I și testul de comparație multiplu Tukey.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(175K, pdf)

Fig S6

Citotoxicitatea pectinei citrice modificate termic asupra celulelor MCF7.

Celulele MCF7 au fost incubate doar cu mediu (Ctl), 50 μM etopozidă (etop), 3 mg/ml pectină citrică hidrolizată (HFCP) sau 3 mg/ml pectină citrică (Pectină). Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul MTT după 24 și 48 de ore de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). ***: p < 0,001 utilizând ANOVA I și testul de comparație multiplu Tukey.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(63K, pdf)

Tabelul S1

Efectul Z-VAD-fmk asupra activității caspazei.

Celulele HepG2 și A549 au fost incubate numai cu mediu (Ctl-), 50 μM etopozidă (Etop), 3 mg/ml pectină citrică hidrolizată (HFCP) sau 3 mg/ml pectină citrică (Pectină), în prezența sau în absența Z-VAD-fmk la 20 μM, un inhibitor al caspazei. Activitatea caspazei a fost măsurată cu ajutorul testului MTT după diferite perioade de incubare. Datele sunt medii de triplicate +/- SD (n = 3). Analizele statistice au fost efectuate cu testul Holm-Sidak și testul ANOVAII. Valoarea P în comparație cu proba corespunzătoare fără Z-VAD-fmk sunt *: P ≤ 0,05; ***: P ≤ 0,001.

(PDF)

Faceți clic aici pentru fișierul cu date suplimentare.(66K, pdf)

Mergi la:

Mulțumiri

Autorii ar dori să mulțumească doamnei Noelle Ninane pentru observațiile de microscopie confocală (platforma tehnologică „morfologie și imagistică” de la Universitatea din Namur) și August & Hildreth (Universitatea Johns Hopkins, Baltimore) pentru anticorpul anti-LAMP1 dăruit.

Mergi la:

Declarație privind finanțarea

L. Leclère a fost destinatarul unei burse FRIA (Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture, Bruxelles, Belgia). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de a publica sau de a pregăti manuscrisul.

Mergi la:

Disponibilitatea datelor

Toate datele relevante se găsesc în lucrare și în fișierele cu informații justificative.

Mergi la:

Bibliografie

1. Hazra B, Ghosh S, Kumar A, Pandey BN (2011) The prospective role of plant products in radiotherapy of cancer: a current overview. Front Pharmacol 2: 94 doi: 10.3389/fphar.2011.00094 [PMC free article] [PubMed]

2. Mohnen D (2008) Pectin structure and biosynthesis. Curr Opin Plant Biol 11: 266–277. doi: 10.1016/j.pbi.2008.03.006 [PubMed]

3. Harholt J, Suttangkakul A, Vibe Scheller H (2010) Biosynthesis of pectin. Plant Physiol153: 384–395. doi: 10.1104/pp.110.156588 [PMC free article] [PubMed]

4. Leclere L, Van Cutsem P, Michiels C (2013) Anti-cancer activities of pH- or heat-modified pectin. Front Pharmacol 4: 128 doi: 10.3389/fphar.2013.00128 [PMC free article] [PubMed]

5. Vayssade M, Sengkhamparn N, Verhoef R, Delaigue C, Goundiam O, et al. (2010) Antiproliferative and proapoptotic actions of okra pectin on B16F10 melanoma cells. Phytother Res 24: 982–989. doi: 10.1002/ptr.3040 [PubMed]

6. Chauhan D, Li G, Podar K, Hideshima T, Neri P, et al. (2005) A novel carbohydrate-based therapeutic GCS-100 overcomes bortezomib resistance and enhances dexamethasone-induced apoptosis in multiple myeloma cells. Cancer Res 65: 8350–8358. [PubMed]

7. Jackson CL, Dreaden TM, Theobald LK, Tran NM, Beal TL, et al. (2007) Pectin induces apoptosis in human prostate cancer cells: correlation of apoptotic function with pectin structure. Glycobiology 17: 805–819. [PubMed]

8. Han SB, Lee CW, Kang MR, Yoon YD, Kang JS, et al. (2006) Pectic polysaccharide isolated from Angelica gigas Nakai inhibits melanoma cell metastasis and growth by directly preventing cell adhesion and activating host immune functions. Cancer Lett 243: 264–273.[PubMed]

9. Nangia-Makker P, Hogan V, Honjo Y, Baccarini S, Tait L, et al. (2002) Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin. J Natl Cancer Inst 94: 1854–1862. [PubMed]

10. Liu HY, Huang ZL, Yang GH, Lu WQ, Yu NR (2008) Inhibitory effect of modified citrus pectin on liver metastases in a mouse colon cancer model. World J Gastroenterol 14: 7386–7391. [PMC free article] [PubMed]

11. Huang ZL, Liu HY (2008) [Expression of galectin-3 in liver metastasis of colon cancer and the inhibitory effect of modified citrus pectin]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao 28: 1358–1361. [PubMed]

12. Cosse JP, Ronvaux M, Ninane N, Raes MJ, Michiels C (2009) Hypoxia-induced decrease in p53 protein level and increase in c-jun DNA binding activity results in cancer cell resistance to etoposide. Neoplasia 11: 976–986. [PMC free article] [PubMed]

13. Chen JW, Cha Y, Yuksel KU, Gracy RW, August JT (1988) Isolation and sequencing of a cDNA clone encoding lysosomal membrane glycoprotein mouse LAMP-1. Sequence similarity to proteins bearing onco-differentiation antigens. J Biol Chem 263: 8754–8758.[PubMed]

14. Hajji N, Wallenborg K, Vlachos P, Nyman U, Hermanson O, et al. (2008) Combinatorial action of the HDAC inhibitor trichostatin A and etoposide induces caspase-mediated AIF-dependent apoptotic cell death in non-small cell lung carcinoma cells. Oncogene 27: 3134–3144. [PubMed]

15. Sohn D, Schulze-Osthoff K, Janicke RU (2005) Caspase-8 can be activated by interchain proteolysis without receptor-triggered dimerization during drug-induced apoptosis. J Biol Chem 280: 5267–5273. [PubMed]

16. Wang KK (2000) Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends Neurosci 23: 20–26. [PubMed]

17. Rommelaere G, Michel S, Malaisse J, Charlier S, Arnould T, et al. (2012) Hypersensitivity of A8344G MERRF mutated cybrid cells to staurosporine-induced cell death is mediated by calcium-dependent activation of calpains. Int J Biochem Cell Biol 44: 139–149. doi: 10.1016/j.biocel.2011.10.009 [PubMed]

18. Harris AS, Morrow JS (1988) Proteolytic processing of human brain alpha spectrin (fodrin): identification of a hypersensitive site. J Neurosci 8: 2640–2651. [PubMed]

19. Janicke RU, Ng P, Sprengart ML, Porter AG (1998) Caspase-3 is required for alpha-fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other death substrates in apoptosis. J Biol Chem 273: 15540–15545. [PubMed]

20. Zeng RX, Zhang YB, Fan Y, Wu GL (2014) p62/SQSTM1 is involved in caspase-8 associated cell death induced by proteasome inhibitor MG132 in U87MG cells. Cell Biol Int.[PubMed]

21. Maiuri MC, Zalckvar E, Kimchi A, Kroemer G (2007) Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 741–752. [PubMed]

22. Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, et al. (2012) Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445–544. [PMC free article] [PubMed]

23. Yan J, Katz A (2010) PectaSol-C modified citrus pectin induces apoptosis and inhibition of proliferation in human and mouse androgen-dependent and- independent prostate cancer cells. Integr Cancer Ther 9: 197–203. doi: 10.1177/1534735410369672 [PubMed]

24. Duriez PJ, Shah GM (1997) Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: a sensitive parameter to study cell death. Biochem Cell Biol 75: 337–349. [PubMed]

25. Chaitanya GV, Steven AJ, Babu PP (2010) PARP-1 cleavage fragments: signatures of cell-death proteases in neurodegeneration. Cell Commun Signal 8: 31 doi: 10.1186/1478-811X-8-31 [PMC free article] [PubMed]

26. Gobeil S, Boucher CC, Nadeau D, Poirier GG (2001) Characterization of the necrotic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1): implication of lysosomal proteases. Cell Death Differ 8: 588–594. [PubMed]

27. de Bruin EC, Meersma D, de Wilde J, den Otter I, Schipper EM, et al. (2003) A serine protease is involved in the initiation of DNA damage-induced apoptosis. Cell Death Differ10: 1204–1212. [PubMed]

28. Suzuki Y, Nakabayashi Y, Takahashi R (2001) Ubiquitin-protein ligase activity of X-linked inhibitor of apoptosis protein promotes proteasomal degradation of caspase-3 and enhances its anti-apoptotic effect in Fas-induced cell death. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 8662–8667. [PMC free article] [PubMed]

29. Laussmann MA, Passante E, Dussmann H, Rauen JA, Wurstle ML, et al. (2011) Proteasome inhibition can induce an autophagy-dependent apical activation of caspase-8. Cell Death Differ 18: 1584–1597. doi: 10.1038/cdd.2011.27 [PMC free article] [PubMed]

30. McStay GP, Salvesen GS, Green DR (2008) Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ 15: 322–331.[PubMed]

31. Soldani C, Scovassi AI (2002) Poly(ADP-ribose) polymerase-1 cleavage during apoptosis: an update. Apoptosis 7: 321–328. [PubMed]

32. Codogno P, Meijer AJ (2005) Autophagy and signaling: their role in cell survival and cell death. Cell Death Differ 12 Suppl 2: 1509–1518. [PubMed]

33. Notte A, Leclere L, Michiels C (2011) Autophagy as a mediator of chemotherapy-induced cell death in cancer. Biochem Pharmacol 82: 427–434. doi: 10.1016/j.bcp.2011.06.015 [PubMed]

34. Mizushima N, Yoshimori T (2007) How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542–545. [PubMed]

35. Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, et al. (1998) Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct23: 33–42. [PubMed]

36. Johansen T, Lamark T (2011) Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins. Autophagy 7: 279–296. [PMC free article] [PubMed]

37. Seibenhener ML, Babu JR, Geetha T, Wong HC, Krishna NR, et al. (2004) Sequestosome 1/p62 is a polyubiquitin chain binding protein involved in ubiquitin proteasome degradation. Mol Cell Biol 24: 8055–8068. [PMC free article] [PubMed]

38. Qiu JH, Asai A, Chi S, Saito N, Hamada H, et al. (2000) Proteasome inhibitors induce cytochrome c-caspase-3-like protease-mediated apoptosis in cultured cortical neurons. J Neurosci 20: 259–265. [PubMed]

39. Chen L, Smith L, Wang Z, Smith JB (2003) Preservation of caspase-3 subunits from degradation contributes to apoptosis evoked by lactacystin: any single lysine or lysine pair of the small subunit is sufficient for ubiquitination. Mol Pharmacol 64: 334–345. [PubMed]

40. Benbrook DM, Long A (2012) Integration of autophagy, proteasomal degradation, unfolded protein response and apoptosis. Exp Oncol 34: 286–297. [PubMed]

 

Lasă un răspuns

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google+

Comentezi folosind contul tău Google+. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest sit folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.