Inhibarea proliferării carcinomului tiroidian malign prin inhibitori ai Ras și galectinei-3

Cell Death Discov. 2015; 1: 15047.

Published online 2015 Nov 2. doi:  10.1038/cddiscovery.2015.47

PMCID: PMC4979473

PMID: 27551476

Inhibarea proliferării carcinomului tiroidian malign prin inhibitori ai Ras și galectinei-3

A Menachem,1,*,3 O Bodner,1,3 J Pastor,1 A Raz,2 and Y Kloog1

Informații despre autori ► Note despre articol ► Informații despre drepturile de autor și licență ►Precizări legale

Acest articol a fost citat de alte articole din PMC.

Mergi la:

REZUMAT

Carcinomul tiroidian anaplastic este o tumoare solidă extrem de agresivă care rezistă majorității tratamentelor și este aproape întotdeauna fatală. Galectina-3 (Gal-3) este un marker important pentru carcinoamele tiroidiene și o schelă a proteinei K-Ras. S-trans, acid transfarnesiltiosalicilic (FTS, Salirasib) este un inhibitor Ras care inhibă formele active ale proteinelor Ras. Pectina citrică modificată (MCP) este o fibră polizaharidică derivată din citrice, care inhibă în mod specific Gal-3. Scopul acestui studiu a fost de a dezvolta o nouă combinație de medicamente concepute pentru a trata carcinomul tiroidian anaplastic agresiv. Tratamentul combinat cu FTS și MCP a inhibat proliferarea celulelor tiroidiene anaplazice in vitro prin inducerea opririi ciclului celular și creșterea ratei de apoptoză. Analiza imunoblot a relevat o scădere semnificativă a nivelurilor de exprimare Pan-Ras, K-Ras, Ras-GTP, p-ERK, p53 și Gal-3 și o creștere semnificativă a nivelurilor de expresie p21. La șoarecii fără blană (nude mice), tratamentul cu FTS și MCP a inhibat creșterea tumorală. Nivelurile de Gal-3, K-Ras-GTP și p-ERK au scăzut semnificativ. În concluzie, rezultatele noastre sugerează K-Ras și Gal-3 ca ținte potențiale în tumorile anafilactice tiroidiene și anunță un tratament nou pentru carcinomul tiroidian anaplastic foarte agresiv.

Mergi la:

INTRODUCERE

Cancerul tiroidian este cea mai frecventă neoplazie endocrină și incidența sa a crescut în ultimele decenii. Majoritatea pacienților cu cancer tiroidian prezintă un rezultat bun atunci când sunt tratați cu terapii standard, care sunt: ​​chirurgie, chimioterapie și radioterapie.1 Prognosticul pentru cei cu boală rezistentă sau recurentă este slab. Clasificarea cancerelor tiroidiene se face după caracteristicile lor histopatologice și clinice, de la tipuri bine diferențiate la tipuri nediferențiate.2 Tipurile bine diferențiate includ carcinom tiroidian papilar și folicular. Acestea sunt mai frecvente și au un prognostic bun. Carcinoamele tiroidiene anaplastice sunt nediferențiate, extrem de agresive, mai puțin frecvente și de obicei letale.3

Au fost descriși câțiva markeri importanți pentru carcinoamele tiroidiene. Unul dintre acestea este galectina-3 (Gal-3), care acționează extracelular ca o proteină β-galactozidă de legare și intracelular ca o schelă a proteinei K-Ras.4-6 Galectinele sunt adesea supraexprimate în celulele canceroase. În multe situații, această expresie a galectinelor modificate se corelează cu agresivitatea tumorii și cu dobândirea fenotipului metastatic, indicând faptul că galectinele pot modula progresia tumorii și pot influența rezultatul bolii.7-11

Familia de galectine poate avea un rol important în ancorarea membranei de Ras și în transformarea celulară mediată de Ras.5,12 Proteinele ​​Ras (H-Ras, K-Ras și N-Ras) sunt membri ai familiei GTPazelor care au roluri vitale în căile de semnalizare celulare care reglează creșterea celulară, diferențierea, proliferarea și moartea celulară.13,14 Mutațiile Ras sunt cunoscute a fi implicate în aproximativ 25-30% din toate cazurile de cancer la om.15,16 Pentru a provoca transformări maligne, Ras oncogen trebuie să se asocieze cu membranele celulare.17,18 S-a constatat că Gal-3 se leagă la proteinele ​​oncogene Ras, dar preferabil la K-Ras, promovează activarea cascadelor importante de semnalizare, incluzând RAF1, fosfatidilinozitol 3-kinaza, calea de semnalizare Ras și reglează expresia genică la nivel de transcripție.5

S-trans, acid trans-farnesiltiosalicilic (FTS, Salirasib) este o moleculă sintetică de mici dimensiuni, care acționează ca un inhibitor puternic al Ras. FTS îndepărtează toate tipurile de proteine ​​oncogene Ras de pe locurile de ancorare în membrană și inhibă transformarea Ras atât in vitro, cât și in vivo.19-22 În studiile anterioare care au fost efectuate în laboratorul nostru, am constatat că FTS inhibă creșterea celulelor canceroase tiroidiene (ARO) in vivo și in vitro și scăderea nivelurilor K-Ras, K-Ras-GTP, p-ERK și Gal-3.23 Pectina citrică modificată (MCP) este o fibră polizaharidică derivată din citrice, care inhibă în mod specific Gal-3. Pectina este o fibră polizaharidică având ramificații foarte complexe, bogată în resturi de galactozidă și prezentă în pereții celulelor tuturor plantelor. În forma sa naivă, pectina citrică (CP) are o solubilitate limitată în apă și nu este capabilă să interacționeze cu Gal-3, dar forma sa modificată (MCP) acționează ca ligand pentru Gal-3.24 MCP induce apoptoza în celulele mielomului multiplu, rezistente la terapiile convenționale. 25 De asemenea, inhibă creșterea tumorală, angiogeneza și metastazarea spontană a celulelor carcinomului mamar și de colon la șoareci fără blană.26

Deși terapiile standard sunt eficiente pentru majoritatea pacienților cu cancer tiroidian, ele nu funcționează bine la pacienții cu carcinoame tiroidiene anaplazice agresive, iar prognosticul pentru acești pacienți este slab. În studiul actual, examinăm tratamentul combinat al inhibitorului Ras, FTS și inhibitorului Gal-3, MCP asupra celulelor carcinomului tiroidian anaplastic (ARO) in vitro și in vivo. Rezultatele noastre arată că tratamentul combinat de FTS și MCP inhibă proliferarea celulelor tumorale in vitro și creșterea tumorilor in vivo. În plus, combinația FTS cu MCP a indus stoparea ciclului celular la faza G1 și apoptoza. Aceste descoperiri noi pot fi relevante din punct de vedere clinic și pot conduce la elaborarea de noi abordări pentru tratarea pacienților cu carcinoame tiroidiene anaplazice agresive.

Mergi la:

REZULTATE

FTS și MCP ACȚIONEAZĂ sinergic ASUPRA celulelOR ARO

Pentru a studia forma interacțiunii dintre FTS și MCP, am folosit indicele de combinație (CI), propus de Berenbaum (Figura 1a).27 În practică, se determină concentrația inhibitorie semi-maximală (IC50) a unui medicament, în prezența unei concentrații constante a celuilalt. Dacă cele două medicamente acționează sinergic, în amestec ar fi necesare concentrații mai scăzute pentru a obține același efect, iar IC va fi mai mic de 1. Am determinat valoarea IC50 a fiecărui medicament administrat în monoterapie și am constatat că valorile IC50 FTS și MCP au fost 55 μ M și respectiv 0,35% (Figurile 1b și c). În continuare, am determinat valoarea IC50 a FTS în prezența concentrației IC50 MCP și viceversa. Am constatat că FTS a redus numărul de celule vii cu un IC50 de 17 μM și MCP a redus numărul de celule vii, cu o valoare IC50 de 0,07% (Figurile 1d și e). Rezultatele noastre arată că amestecul de FTS și MCP are o valoare CI de 0,5 și acționează sinergic asupra celule ARO (Figura 1f).

> 1 pentru antagonism IC50,A – IC50 pentru medicamentul A în monoterapie

= 1 pentru adunare IC50,B – IC50 pentru medicamentul B în monoterapie

< 1 pentru sinergie D1 – IC50 pentru medicamentul A în prezența IC50,B

D2- IC50 pentru medicamentul B în prezența IC50,A

% din celule vii

FTS în monoterapie

Concentrația FTS

 

Deschide într-o fereastră separată

Figura 1

Tratamentul combinat FTS și MCP acționează sinergic asupra celulelor ARO (a) Indexul combinat (CI), propus de Berenbaum. Dacă cele două medicamente acționează sinergic, CI va fi mai mic de 1 așa cum este descris în rezultate. (b-e) Rezultatele testelor de viabilitate celulară. (b) Răspuns la doză FTS M) cu un IC50 de 55   μM. (c) Răspuns la doză MCP (%) cu un IC50 de 0,35%. (d) Valoarea IC50 FTS în prezență de 0,35% MCP a redus numărul de celule vii cu un IC50de 17 μM. (e) Valoarea IC50 MCP în prezența a 50 μM FTS a redus numărul de celule vii, cu o valoare IC50 de 0,07%. (f) Rezultatele noastre arată că combinația dintre FTS și MCP are o valoare CI de 0.509, sugerând astfel că medicamentele funcționează sinergic asupra ARO.

TRATAMENTUL COMBINAT CU FTS ȘI MCP REGLEMENTEAZĂ ACTIV ÎN SENS DESCRESCĂTOR EXPRESIA RAS-GTP P-ERK ȘI GAL-3 

Pentru a studia efectul tratamentului combinat cu FTS și MCP asupra expresiei proteinelor, am tratat celule ARO cu FTS și MCP timp de 48 de ore și am evaluat expresia proteinei prin analiză imunoblot. Nivelurile Ras-GTP au fost evaluate prin teste pull-down asupra GTPazelor, așa cum este descris în Materiale și metode. Așa cum se arată în Figurile 2a și b, tratamentul cu FTS+MCP a redus în mod semnificativ RAS-GTP și nivelul total al Ras cu 37 și respectiv 46% [P < 0,01, ANOVA unirecțională; P < 0,01, testul diferenței oneste semnificative (HSD) Tukey] și nivelurile totale ale K-Ras cu 62% (P < 0,001, ANOVA unirecțională, P < 0,001, testul HSD Tukey) comparativ cu celulele netratate. Pentru a evalua în continuare influența tratamentului combinat asupra căilor de semnalizare Ras, am examinat fosfo-ERK (p-ERK), o importantă proteină descendentă în nivelurile de expresie ale căii Raf/MEK/ERK (Figura 2c). Am constatat că, deși tratamentul FTS+MCP a afectat ușor ERK total (Figura 2d; P > 0,05, ANOVA unirecțională), a redus semnificativ nivelurile de expresie p-ERK cu 60% în raport cu celulele netratate (Figura 2dP < 0,05, ANOVA unirecțională; P < 0,05, testul HSD Tukey). Deoarece p-Akt nu este detectat în celulele ARO, acesta nu a fost utilizat drept citire pentru semnalizarea Ras.23

b) % (în funcție de martor)

 

Deschide într-o fereastră separată

Figura 2

Tratamentul combinat al FTS și MCP reglează Ras și moleculele sale de semnalizare din aval. Tratamentul combinat al FTS și MCP scade nivelurile de expresie ale Galectin-3, Pan-Ras, K-Ras, Pan-Ras-GTP, p-ERK și p53 și a crește nivelurile de expresie ale p21. Celulele ARO au fost placate și tratate cu 75 μM FTS și 0,35% MCP, așa cum este descris în Metode și materiale. După 48/72 h, celulele au fost lizate și supuse imunoblotării. (a) Imunobloturi reprezentative de Gal-3, Pan-Ras și K-Ras normalizate la β- tubulină și Pan-Ras-GTP au fost vizualizate prin ECL. (b) Nivelurile aparente de galectină-3, Pan-Ras, K-Ras și Pan-Ras-GTP au fost determinate prin densitometria (a.u.) a imunobloturilor. Nivelurile Gal-3, Pan-Ras, K-Ras și Pan-Ras-GTP au fost în mod semnificativ scăzute în celulele tratate cu FTS+MCP (bara albă) comparativ cu celulele netratate (bara neagră), celulele tratate cu FTS (bara gri) și celulele tratate cu MCP (celule cu diagonală). Nivelurile Gal-3, Pan-Ras, K-Ras and Pan-Ras-GTP au scăzut semnificativ în celulele tratate cu FTS+MCP (c) Imunobloturi reprezentative din ERK și p-ERK totale normalizate la actină, vizualizate prin ECL (d) Nivelurile aparente ale ERK și p-ERK totale determinate prin densitometria (a.u.) imunobloturilor. Nivelurile P-ERK au fost în mod semnificativ scăzute în celulele tratate cu FTS+MCP (bara albă) comparativ cu celulele netratate (bara neagră), celulele tratate cu FTS (bara gri) și celulele tratate cu MCP (celule cu diagonală). (e) Imunobloturi pentru p21 și p53 normalizate la actină. (f) Nivelurile aparente de p21 și p53 au fost determinate prin densitometrie (a.u.). Nivelurile p21 au fost în mod semnificativ crescute și p53 au fost în mod semnificativ scăzute în celulele tratate cu FTS+MCP (bara albă) comparativ cu celulele netratate (bara neagră), celulele tratate cu FTS (bara gri) și celulele tratate cu MCP (celule cu diagonală). Rezultatele sunt prezentate ca medii ± SEM; analiza ANOVA unidirecțională a evidențiat diferențe semnificative între grupuri; analiza post hoc a fost efectuată prin testul HSD; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Apoi, am examinat efectul FTS și MCP asupra nivelurilor Gal-3. Deși MCP și FTS+MCP au redus semnificativ nivelurile expresiei Gal-3 la 70% față de celulele netratate, FTS a avut un efect minor asupra nivelurilor expresiei Gal-3 (Figurile 2a și b; P < 0,01, ANOVA unidirecțională; P < 0,05; testul HSD Tukey).

TRATAMENTUL COMBINAT CU FTS ȘI MCP CREȘTE NIVELURILE DE EXPRESIE P21 ȘI REDUCE NIVELURILE DE EXPRESIE P53

Apoi, am examinat dacă tratamentul combinat cu FTS și MCP afectează expresia p21 și p53 (Figura 2e). P21 este un regulator important al ciclului celular, care induce stoparea ciclului celular la fazele G1 și G2/M.28 În plus, anterior s-a demonstrat că Ras activ reglează negativ expresia p21.23 Am constatat că FTS+MCP a crescut semnificativ nivelurile p21 cu 85% în raport cu celulele netratate (Figura 2f; P < 0,01, ANOVA unidirecțional; P < 0,01, testul HSD Tukey). P53 este o importantă genă supresoare tumorală, care reglementează pozitiv transcripția p21. Anterior, s-a arătat că inhibarea Ras conduce la activarea transcripțională a p53.29, 30 Am constatat că FTS+MCP a scăzut semnificativ nivelurile p53 cu 66% comparativ cu celulele netratate (Figura 2f; P < 0,0001, ANOVA unidirecțională, P < 0,0001, testul HSD Tukey).

TRATAMENTUL COMBINAT CU FTS ȘI MCP INDUCE ÎNTRERUPEREA CICLULUI CELULAR G1 ȘI APOPTOZA ÎN CELULELE ARO

După ce s-a demonstrat că tratamentul combinat cu FTS și MCP a crescut expresia p21, am examinat în continuare dacă un tratament combinat cu FTS și MCP afectează ciclul celular. Pentru a evalua ciclul celular am realizat colorarea cu iodură de propidiu (PI), o metodă bine cunoscută pentru analiza ciclului celular. O reprezentare punctuală reprezentativă a analizei de sortare a celulelor activate fluorescent (FACS) asupra celulelor tratate prin colorare PI este prezentată în Figura 3a. FTS+MCP a crescut semnificativ procentul celulelor ARO în faza G1 în comparație cu celulele ARO netratate (Figura 3b, media ± SEM, 76,2 ± 12,1, 73,8 ± 10,7 și respectiv 55 ± 6,8, P < 0,001, ANOVA unidirecțională, P < 0,05, testul HSD Tukey). Procentajul de celule în fazele S a fost semnificativ mai mic în celulele tratate cu FTS și celulele tratate cu FTS+MCP, comparativ cu celulele netratate (Figura 3b; medie ± SEM, 10,7 ± 8,6, 6,1 ± 2,2 și respectiv 28,5 ± 4,3; P < 0,0001, ANOVA unidirecționată, P < 0,001, testul HSD Tukey). Datele sugerează că FTS+MCP a crescut semnificativ procentul celulelor ARO în sub-faza G1 în comparație cu celulele ARO netratate (Figura 3b, media ± SEM, 7,8 ± 2,6 și respectiv 2,6 ± 1,5, P < 0,01, ANOVA unidirecțională, P < 0,01, testul HSD Tukey). În lumina acestor rezultate, am examinat dacă FTS+MCP induc apoptoza în celulele ARO. Analiza apoptozei a fost efectuată prin metodologia de colorare cu anexină-V și PI.31 Rezultatele reprezentative ale graficelor punctuale ale analizei FACS sunt prezentate în Figura 3c. Celulele ARO care au fost tratate cu FTS+MCP au prezentat un procent semnificativ mai mare de celule apoptotice comparativ cu celulele martor netratate (Figura 3d; P < 0,01, ANOVA unidirecțională, P < 0,001, testul HSD Tukey). Procentul de celule ARO necrotice a fost semnificativ mai mare în cazul celulelor tratate cu FTS+MCP comparativ cu martorii (Figura 3d, P < 0,05, ANOVA unidirecțională, P < 0,05, testul HSD Tukey). Rezultatele noastre arată că tratamentul combinat cu FTS și MCP induce stoparea G1 și apoptoza în celulele ARO.

Martor / FTS

Celule

% din celule % din celule (comparativ cu martorul)

Apoptoză incipientă / Necroză

 

Figura 3

Tratamentul combinat cu FTS și MCP determină apoptoza și oprirea ciclului celular G1. (a și b) Pentru analiza ciclului celular, celulele ARO (5 x 104) au fost placate și tratate pentru 72 de ore fie cu FTS, MCP sau FTS+MCP. (a) Histograme reprezentative ale analizei FACS a celulelor tratate prin colorare PI. (b) Cuantificarea analizei FACS: se prezintă cantitatea de celule în fazele ciclurilor celulare G1, S și G2M și sub-G1 ale martorului (bara neagră), celulelor ARO tratate cu FTS (bara gri), tratate cu MCP (bara cu diagonală) și FTS+MCP (bara albă). Cantitatea de celule în fazele G1 și sub-G1 a fost semnificativ mai mare în celulele tratate cu FTS+MCP comparativ cu celulele netratate. Cantitatea de celule în fazele S a fost semnificativ mai scăzută în celulele tratate cu FTS și celulele tratate cu FTS+MCP, comparativ cu celulele netratate (c și d) Pentru a examina dacă tratamentul combinat al FTS și MCP induce apoptoza, celulele ARO (2,5 x 105) au fost tratate fie cu FTS, MCP, fie cu FTS+MCP timp de 48 de ore. (c) Reprezentarea punctuală a analizei FACS a celulelor tratate prin colorare cu anexină-V și PI. Numerele din cadrane reprezintă procentul celulelor ARO din fiecare cadran. (d) Cuantificarea analizei FACS: Barele din partea stângă: celule ARO apoptotice (anexina-V ridicat, PI scăzut) în celule netratate (bara martor neagră), tratate cu FTS (bara gri), tratate cu MCP (bara cu diagonală) și celule ARO tratate cu FTS+MCP (bara albă). Barele din partea dreaptă: celule ARO necrotice (anexina-V ridicată, PI ridicată) în celule netratate (bara martor neagră), tratate cu FTS (bara gri), tratate cu MCP (bara cu diagonală) și celule ARO tratate cu FTS+MCP (bara albă). Apoptoza a fost semnificativ crescută la celulele tratate cu FTS+MCP comparativ cu martorul. Rezultatele sunt prezentate ca medii ± SEM; analiza ANOVA unidirecțională a evidențiat diferențe semnificative între colorarea cu anexină-V și PI; analiza post hoc a fost efectuată folosind testul HSD; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (a și bn=5; c și dn = 3); FTS, acid S-farnesiltiosalicilic; MCP, pectină citrică modificată; PI, fosfatidilinozitidă.

TRATAMENTUL COMBINAT CU FTS ȘI MCP INHIBĂ CREȘTEREA TUMORII IN VIVO

Apoi, am examinat dacă tratamentul combinat cu FTS și MCP poate inhiba creșterea carcinoamelor tiroidiene într-un model de șoarece. Șoarecii au fost injectați cu celule ARO și tratați cu FTS, MCP, FTS+MCP sau vehicul așa cum este descris în Materiale și metode. După cum se arată în Figurile 4a și b, FTS+MCP a redus semnificativ volumul și greutatea tumorii în comparație cu grupurile FTS, MCP și martor (P < 0,05, ANOVA unidirecțională, P < 0,01, testul HSD Tukey). Analiza efectelor grupului și a timpului prin ANOVA bidirecțională univariată a evidențiat un efect semnificativ al grupului și al timpului (P < 0,0001). A existat un efect semnificativ pentru interacțiunea grup × timp (P < 0,01). Rezultatele analizei farmacodinamice sunt prezentate în Figurile 4c și d. Nivelurile Gal-3 și p-ERK au fost semnificativ scăzute de tratamentul cu FTS+MCP [P < 0,05, ANOVA unidrecțională; P < 0,05, testul Fisher al celei mai puțin semnificative diferențe (LSD)]. În plus, tratamentul cu FTS+MCP a redus semnificativ nivelurile expresiei K-Ras-GTP (Figurile 4c și d; P < 0,05, ANOVA unidrecțională, P < 0,05, testul HSD Tukey). Luate împreună, aceste rezultate arată că în mod combinat, FTS și MCP și-au lovit țintele în tumori și au inhibat creșterea tumorii tiroidiene anaplastice in vivo.

Martor % din martor

Zile Greutatea tumorii

 

Deschide într-o fereastră separată

Figura 4

Tratamentul combinat cu FTS și MCP inhibă creșterea celulelor tumorilor tiroidiene ARO într-un model de șoarece fără blană. Celulele ARO au fost injectate subcutanat în zonele de flanc ale șoarecilor fără blană; volumele tumorale și greutățile au fost determinate așa cum este descris în Materiale și metode. (a) Volumul tumoral în șoareci tratați cu FTS, MCP, FTS+MCP și șoareci martor în funcție de timp; puncte-media; bare-SEM; C-martor, F-FTS, M-MCP, F+M-FTS+MCP. (b-d) După 35 de zile, șoarecii au fost omorâți, tumorile au fost cântărite și apoi omogenizate pentru analiza imunoblot. (b) Greutatea tumorală a șoarecilor martor (bara neagră), tratați cu FTS (bara gri), MCP (bara â în sus) și FTS+MCP (bara albă). (c) Imunobloturi reprezentative pentru p-ERK și Gal-3 normalizate la actină și K-Ras-GTP, vizualizate prin ECL. (b) Niveluri aparente de galectină-3, p-ERK și Pan-Ras-GTP determinate prin densitometria (a.u.) imunobloturilor. Rezultatele sunt prezentate ca medii ± SEM; analiza ANOVA unidirecțională a evidențiat diferențe semnificative între volumele tumorilor, greutățile tumorilor și nivelurile de proteine; analiza post hoc a fost efectuată prin testul HSD și testul LSD Fisher. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001; FTS, acid S-farnesiltiosalicilic; MCP, pectină citrică modificată.

Mergi la:

DISCUȚIE

Carcinomul tiroidian anaplastic este o tumoare solidă, extrem de agresivă, care rezistă majorității tratamentelor și este aproape întotdeauna fatală.3,32 Gal-3 servește ca marker de diagnostic pentru diferențierea dintre cancerele tiroidiene benigne și maligne,33 iar rolul Ras în aceste tumori este, de asemenea, bine documentat.23 Deoarece s-a raportat că Gal-3 acționează ca un partener de legare specific al K-Ras activat și că această interacțiune promovează activarea K-Ras,5 am abordat posibila utilizare a acestor ținte pentru o posibilă modalitate terapeutică împotriva carcinomului tiroidian anaplazic. Rezultatele noastre arată că tratamentul combinat cu FTS și MCP inhibă proliferarea celulelor ARO in vitro și a redus creșterea tumorilor in vivo. FTS este un inhibitor puternic al Ras, care interferează cu interacțiunile dintre Ras (Ras-GTP) activ și membrana celulară, în special prin întreruperea interacțiunilor dintre galectină și Ras-GTP în membrana plasmatică celulară. Dislocarea Ras de membrana plasmatică la citoplasm duce la degradarea sa.55,12,34,35 S-a demonstrat că FTS inhibă creșterea tumorală în mai multe tipuri de cancer.21,23,36,37MCP este un inhibitor specific gal-3 care poate lega domeniul de legare a carbohidraților de Gal-3, ca rezultat al grupelor sale de zahăr și îi blochează activitatea. Studiile anterioare au descoperit că MCP inhibă creșterea tumorală, angiogeneza și metastazarea spontană a carcinomului de colon și a cancerului de sân.25,26,38,39

Celulele de cancer tiroidian exprimă Gal-3,23,33,40,41 o lectină de legare a beta-galactozidei, care se asociază cu dezvoltarea și malignitatea multor tipuri de tumori.42 Supraexprimarea Gal-3 promovează transformarea neoplazică prin interacțiunea cu K-Ras-GTP, creșterea ancorării K-Ras-GTP la membrana celulară și facilitarea activării căilor de semnal din aval.5 În studiul de față, am constatat că tratamentul combinat cu FTS și MCP a redus semnificativ expresia K-Ras și Gal-3. Nivelurile scăzute de K-Ras și Gal-3 au fost asociate cu inhibarea creșterii celulelor tumorale in vitro și in vivo.23 Rezultatele prezentate aici sunt în concordanță cu un studiu anterior care arată că FTS inhibă proliferarea celulelor canceroase tiroidiene in vitro și in vivo, reduce nivelurile de expresie ale Ras-GTP și ale moleculei sale de semnalizare în aval p-ERK și crește nivelurile de expresie ale p21.23

P21 este un regulator important al ciclului celular, care induce stoparea ciclului celular la fazele G1 și G2/M.28,43 Într-adevăr, rezultatele noastre au arătat că tratamentul combinat cu FTS și MCP a crescut nivelurile p21 și a indus stoparea ciclului celular în faza G1. P21 este reglat negativ, în parte, de Ras și, în consecință, FTS crește nivelurile p21.23,29 În plus, nivelurile p21 sunt reglate în sens crescător în celulele PC3 de prăbușire a Gal3 (cancerul de prostată uman), împreună cu stoparea ciclului celular în faza G1.38 Gal-3 promovează progresia ciclului celular prin creșterea expresiei ciclinei D și c-MYC.44-46 În celulele mielomului, MCP induce stoparea G1 și apoptoza prin reglarea în sens crescător a expresiei p21.39 Rezultatele noastre au arătat ca tratamentul combinat FTS+MCP a scăzut semnificativ nivelurile de p53. P53 este o importantă genă supresoare tumorală care se leagă de ADN și activează sute de gene, inclusiv p21.47 Cu toate acestea, expresia p21 poate fi reglată independent de p53.47 Pe de altă parte, deoarece celulele ARO exprimă un nivel ridicat de proteine mutante p53,48 aceasta sugerează că reducerea nivelului de exprimare a proteinei p53 ar putea implica un rezultat pozitiv. De asemenea, raportăm că un tratament combinat al inhibitorilor FTS și MCP a determinat apoptoza celulelor ARO. S-a arătat anterior că MCP induce apoptoza în celulele mielomului multiplu și declanșează apoptoza asociată cu activarea căii caspazei-8 și a caspazei-3 urmată de scindarea proteolitică a polimerazei (ADP-riboză) PARP.25

Rezultatele prezente în sistemul preclinic cu un model de șoarece fără blană au arătat fezabilitatea acestei sugestii, deoarece FTS și MCP au redus nivelurile de exprimare ale Gal-3, K-Ras-GTP active și fosfo-ERK în tumorile ARO și au redus semnificativ dimensiunea tumorii. Luate împreună, rezultatele descrise aici susțin sugestia că inhibarea K-Ras și Gal-3 ar trebui considerată ca un nou tratament terapeutic pentru pacienții care suferă de carcinom tiroidian anaplastic.

Mergi la:

MATERIALE ȘI METODE

CULTURA CELULARĂ ȘI REACTIVI

Celulele ARO au fost păstrate în mediu RPMI-1640 (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel, 100 unități/ml penicilină și 5% l-glutamină. Toți reactivii au fost achiziționați de la Biological Industries. Celulele au fost incubate la 37 °C într-o atmosferă umidificată cu 95% aer/5% CO2. FTS a fost donat de Concordia Pharmaceuticals (Fort Lauderdale, FL, SUA). MCP a fost preparat așa cum este descris.26

TESTAREA PROLIFERĂRII ȘI SUPRAVIEȚUIRII CELULELOR

Pentru experimentul de răspuns la doză FTS, celulele ARO au fost placate într-o placă cu 96 de godeuri (0,5 x 104 celule/godeu); după 24 de ore, celulele au fost tratate cu FTS la diferite concentrații (25, 37, 50, 62,5, 75 și 100 μM) sau, ca martor, cu 0,1% dimetilsulfoxid timp de 96 de ore. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul de colorare cu albastru de metilen. Pentru experimentul de răspuns în funcție de doza MCP, celulele ARO au fost placate (0,5 x 105 celule/godeu) într-o placă cu 24 de godeuri; după 24 de ore, celulele au fost tratate cu MCP la concentrații diferite (0,1, 0,2, 0,3, 0,4 și 0,5%) sau, ca martor, cu d-lactoză 0,5%. După 96 de ore, celulele au fost numărate. Pentru a măsura efectul combinat al FTS și MCP, celulele ARO au fost placate într-o placă cu 24 de godeuri (0,5 x 105 celule/godeu); după 24 de ore, celulele au fost tratate fie cu FTS în diferite concentrații (25, 50, 75 și 100 μM) plus IC50 al MCP sau cu MCP în diferite concentrații (0,1, 0,2, 0,3 și respectiv 0,4%) plus IC50 al FTS. După 96 de ore, celulele au fost numărate. Viabilitatea celulelor a fost calculată ca raportul dintre celulele vii din culturile tratate și cele din culturile netratate.

ANALIZA PRIN COLORARE CU ALBASTRU DE METILEN

Celulele au fost fixate cu formaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) timp de 2 ore, apoi spălate o dată cu acid boric 0,1 M (pH 8,5) și incubate cu colorantul de legare de ADN, albastru de metilen (1% în acid boric) timp de min. 20 de minute, la temperatura camerei. Celulele au fost apoi spălate de trei ori cu apă distilată și lizate cu HCI 0,1 M. Absorbanța a fost măsurată cu un spectrofotometru Tecan Spectrafluor Plus (Mannedorf, Elveția) la 595 nm. Viabilitatea celulelor a fost calculată ca raportul dintre absorbanța din culturile tratate și cea din culturile netratate.

ANALIZA IMUNOBLOT

Celulele ARO au fost placate în plăci de 10 cm (8 x 105 celule) și crescute timp de 24 ore. Celulele au fost apoi tratate fie cu 0,35% MCP, 75 μM FTS, 0,35% MCP plus 75 μM FTS sau ca martor, cu 0,35% d-lactoză timp de 48 de ore. Într-un al doilea set de experimente, celulele au fost tratate fie cu 0,35% MCP, 75 μM FTS, 0,35% MCP plus 75μ M FTS sau ca martor, cu 0,35% d-lactoză timp de 72 de ore. Apoi, celulele au fost lizate în 300 μl soluție tampon de omogenizare (50 mmol/l Tris-HCI pH 7,6, 20 mM MgCl2, 200 mM NaCI, 0,5% NP40, 1 mM DTT și inhibitori de protează), centrifugate timp de 10 min. la 14.000 rpm la 4 °C și supernatantul a fost colectat. Cantități egale de proteine (40 μg pe fiecare bandă) au fost supuse la SDS-PAGE, urmat de imunoblotare cu anticorpi de șoarece anti-pan-Ras (Ab, Calbiochem, San Diego, CA, SUA), anticorpi de iepure anti β-tubulină (Sigma Aldrich, Rehovot, IL, SUA), anti-K-Ras de șoarece (Calbiochem), anti-galectina-3 de șobolan (Mac2), anti-total ERK de iepure (Santa Cruz, Dallas, TX, SUA), anti-p-ERK (Sigma Aldrich), anti-p21 de iepure (Santa Cruz), anti-p53 de șoarece (Calbiochem) și anti-actină de șoarece (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, SUA). Bloturile au fost apoi expuse la IgG cuplat cu peroxidază secundară (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, SUA) și au fost supuse unei chemiluminescențe sporite. Benzile de proteine ​​au fost cuantificate prin densitometrie cu software-ul Image EZQuant-Gel (EZQuant Ltd, Tel-Aviv, Israel).

ANALIZE PULL-DOWN ALE GTPAZEI

Pentru a măsura nivelurile Ras-GTP, am folosit analizele pull-down ale GTPazei. Lizate conținând 1 mg de proteină au fost utilizate pentru a determina conținutul de Ras-GTP prin analiza pull-down a glutationilor S -transferază-RBD (domeniul de legare la Ras al Raf), urmată de Western imunoblotare cu Ac pan-Ras și Ac K-Ras după cum s-a descris în altă parte.35

ANALIZA CICLULUI CELULAR

Pentru a testa dacă FTS și MCP afectează ciclul celular, celulele ARO au fost placate în șase godeuri (5 x 104 celule per godeu) și tratate 24 de ore mai târziu, fie cu FTS (75 μM), MCP (0,35%), MCP plus FTS sau, ca martor, cu d-lactoză (0,35%) timp de 48 de ore. După 48 de ore, celulele au fost colectate, peletate, spălate cu PBS, resuspendate în 0,5 ml PBS și tratate cu RNază A/T1 (0,2%, Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) pentru a elimina ARN-ul din celule (30 min, 37 °C). Apoi, 0,05% PI (50 μg/ml, Sigma Aldrich) și 0,05% Triton X-100 (1%, Sigma Aldrich), au fost adăugate la celule. Analiza citometriei în flux a fost efectuată utilizând Becton Dickinson FACSort (Los Angeles, CA, SUA) și rezultatele au fost analizate cu software-ul FlowJo (Ashland, OR, SUA). Toate experimentele au fost efectuate în duplicat și de cinci ori.

ANALIZA APOPTOZEI

Pentru a cuantifica procentul de celule supuse apoptozei, am folosit anexina-V-FITC (kit de apoptoză MEBCYTO, MBL, Nagoya, Japonia). Celulele ARO au fost placate în șase godeuri (2 x 105 celule per godeu) și tratate 24 de ore mai târziu, fie cu FTS (75 μM), MCP (0,35%), MCP plus FTS sau ca martor cu d-lactoză (0,35%) timp de 48 de ore. După 48 de ore, celulele au fost colectate, spălate cu PBS, resuspendate în soluție tampon de legare și analizate prin colorare dublă cu anexina-V-FITS și PI conform instrucțiunilor producătorului. Analiza citometriei în flux a fost efectuată utilizând Becton Dickinson FACSort și rezultatele au fost analizate cu software-ul FlowJo. Toate experimentele au fost efectuate în duplicat și de trei ori.

EXPERIMENT IN VIVO

Șoarecii fără blană și timus (cu vârsta de 6 săptămâni) au fost obținuți de la Harlan Laboratories Limited (Ierusalim, Israel). Șoarecii au fost ținuți la Facultatea de Științele Naturii, Universitatea din Tel Aviv, facilitatea pentru animale, în condiții standard, de 23 ± 1 °C, 12 h ciclu lumină (7 ± 19) cu acces ad libitum la alimente și băuturi. În ziua 0, celulele ARO (2,5 x 106 în 0,1 ml de PBS) au fost implantate subcutanat, chiar deasupra articulației femurale din partea dreaptă. FTS (40 mg/kg) a fost administrat zilnic pe cale orală cu 0,1 ml CMC (0,5% g/v). MCP (0,5%) a fost administrat la șoareci cu apă de băut (5 ml/zi). Când volumul tumorii a ajuns la 0.3-0.5 cm3, șoarecii au fost separați în mod aleatoriu în patru grupe: martor, FTS, MCP și FTS+MCP. Șoarecii martor au fost hrăniți zilnic cu 0,1 ml CMC și au primit CP (0,5%) în apa de băut (5 ml/zi); grupul FTS a primit 0,5% CP în apa de băut (5 ml/zi). Șoarecii MCP au fost hrăniți zilnic cu 0,1 ml CMC. Volumele tumorilor au fost măsurate la fiecare 4 zile după cum s-a descris anterior.35 După 35 de zile, șoarecii au fost omorâți, tumorile au fost cântărite și apoi omogenizate pentru analiza imunoblotului în soluție tampon de liză (10% g/v). Comisia pentru bunăstarea animalelor din Universitatea Tel Aviv a aprobat toate procedurile.

Analiză statistică

Rezultatele sunt exprimate ca valori medii ± SEM. Valorile P au fost calculate prin ANOVA unidirecțională și ANOVA bidirecțională. Analiza post hoc a fost efectuată prin testul HSD Tukey și prin testul LSD Fisher.

Mergi la:

MULȚUMIRI

Susținut în parte de grantul NIH/NCI # 5R37CA046120 acordat AR.

Mergi la:

GLOSAR

 

Mergi la:

OBSERVAȚII

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Mergi la:

BIBLIOGRAFIE

  • Ahuja S , Ernst H . Chemotherapy of thyroid carcinoma. J Endocrinol Invest 1987; 10: 303–310. [PubMed]
  • Hunt JL , Tometsko M , LiVolsi VA , Swalsky P , Finkelstein SD , Barnes EL . Molecular evidence of anaplastic transformation in coexisting well-differentiated and anaplastic carcinomas of the thyroid. Am J Surg Pathol 2003; 27: 1559–1564. [PubMed]
  • Sipos JA , Mazzaferri EL . The therapeutic management of differentiated thyroid cancer. Expert Opin Pharmacother 2008; 9: 2627–2637. [PubMed]
  • Shalom-Feuerstein R , Cooks T , Raz A , Kloog Y . Galectin-3 regulates a molecular switch from N-Ras to K-Ras usage in human breast carcinoma cells. Cancer Res 2005; 65: 7292–7300. [PubMed]
  • Elad-Sfadia G , Haklai R , Balan E , Kloog Y . Galectin-3 augments K-ras activation and triggers a ras signal that attenuates ERK but not phosphoinositide 3-kinase activity. J Biol Chem 2004; 279: 34922–34930. [PubMed]
  • Liu FT , Patterson RJ , Wang JL . Intracellular functions of galectins. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 263–273. [PubMed]
  • Danguy A , Camby I , Kiss R . Galectins and cancer. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 285–293. [PubMed]
  • Van Den Brûle F , Califice S , Castronovo V . Expression of galectins in cancer: a critical review. Glycoconj J 2002; 19: 537–542. [PubMed]
  • Huflejt ME , Leffler H . Galectin-4 in normal tissues and cancer. Glycoconj J 2003; 20: 247–255. [PubMed]
  • Lahm H , André S , Hoeflich A , Kaltner H , Siebert HC , Sordat B și colab. Tumor galectinology: Insights into the complex network of a family of endogenous lectins. Glycoconj J 2003; 20: 227–238. [PubMed]
  • Bidon-Wagner N , Le Pennec JP . Human galectin-8 isoforms and cancer. Glycoconj J 2002; 19: 557–563. [PubMed]
  • Paz A , Haklai R , Elad-Sfadia G , Ballan E , Kloog Y . Galectin-1 binds oncogenic H-Ras to mediate Ras membrane anchorage and cell transformation. Oncogene 2001; 20: 7486–7493. [PubMed]
  • Cox AD , Der CJ . Farnesyltransferase inhibitors and cancer treatment: targeting simply ras?. Biochim Biophys Acta 1997; 1333: 51–71. [PubMed]
  • Trent JC , McConkey DJ , Loughlin SM , Harbison MT , Fernandez A , Ananthaswamy HN . Ras signaling in tumor necrosis factor-induced apoptosis. EMBO J 1996; 15: 4497–4505. [PMC free article] [PubMed]
  • Crul M , de Klerk GJ , Beijnen JH , Schellens JH . Ras biochemistry and farnesyl transferase inhibitors: a literature survey. Anticancer Drugs2001; 12: 163–184. [PubMed]
  • Adjei AA . Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy. J Natl Cancer Inst 2001; 93: 1062–1074. [PubMed]
  • Gutierrez L , Magee AI , Marshall CJ , Hancock JF . Post-translational processing of p21ras is two-step and involves carboxyl-methylation and carboxy-terminal proteolysis. EMBO J 1989; 8: 1093–1098. [PMC free article] [PubMed]
  • Hancock JF , Magee AI , Childs JE , Marshall CJ . All ras proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated. Cell 1989; 57: 1167–1177. [PubMed]
  • Gana-Weisz M , Halaschek-Wiener J , Jansen B , Elad G , Haklai R , Kloog Y . The Ras inhibitor S-trans,trans-farnesylthiosalicylic acid chemosensitizes human tumor cells without causing resistance. Clin Cancer Res 2002; 8: 555–565. [PubMed]
  • Weisz B , Giehl K , Gana-Weisz M , Egozi Y , Ben-Baruch G , Marciano D și colab. A new functional Ras antagonist inhibits human pancreatic tumor growth in nude mice. Oncogene 1999; 18: 2579–2588. [PubMed]
  • Haklai R , Elad-Sfadia G , Egozi Y , Kloog Y . Orally administered FTS (salirasib) inhibits human pancreatic tumor growth in nude mice. Cancer Chemother Pharmacol 2008; 61: 89–96. [PubMed]
  • Erlich S , Tal-Or P , Liebling R , Blum R , Karunagaran D , Kloog Y și colab. Ras inhibition results in growth arrest and death of androgen-dependent and androgen-independent prostate cancer cells. Biochem Pharmacol 2006; 72: 427–436. [PubMed]
  • Levy R , Grafi-Cohen M , Kraiem Z , Kloog Y . Galectin-3 promotes chronic activation of K-Ras and differentiation block in malignant thyroid carcinomas. Mol Cancer Ther 2010; 9: 2208–2219. [PubMed]
  • Nangia-Makker P , Conklin J , Hogan V , Raz A . Carbohydrate-binding proteins in cancer, and their ligands as therapeutic agents. Trends Mol Med 2002; 8: 187–192. [PubMed]
  • Chauhan D , Li G , Podar K , Hideshima T , Neri P , He D și colab. A novel carbohydrate-based therapeutic GCS-100 overcomes bortezomib resistance and enhances dexamethasone-induced apoptosis in multiple myeloma cells. Cancer Res 2005; 65: 8350–8358. [PubMed]
  • Nangia-Makker P , Hogan V , Honjo Y , Baccarini S , Tait L , Bresalier R și colab. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1854–1862. [PubMed]
  • Breitinger H-G . Drug synergy—mechanisms and methods of analysis. Toxic Drug Test 2012; Chapter 7: 143–166. Available at http://www.intechopen.com/books/toxicity-and-drug-testing/drug-synergy-mechanisms-and-methods-of-analysis.
  • Cayrol C , Knibiehler M , Ducommun B . p21 binding to PCNA causes G1 and G2 cell cycle arrest in p53-deficient cells. Oncogene 1998; 16: 311–320. [PubMed]
  • Halaschek-Wiener J , Wacheck V , Schlagbauer-Wadl H , Wolff K , Kloog Y , Jansen B . A novel Ras antagonist regulates both oncogenic Ras and the tumor suppressor p53 in colon cancer cells. Mol Med 2000; 6: 693–704. [PMC free article] [PubMed]
  • Halaschek-Wiener J , Wacheck V , Kloog Y , Jansen B . Ras inhibition leads to transcriptional activation of p53 and down-regulation of Mdm2: two mechanisms that cooperatively increase p53 function in colon cancer cells. Cell Signal 2004; 16: 1319–1327. [PubMed]
  • Vermes I , Haanen C , Steffens-Nakken H , Reutelingsperger C . A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995; 184: 39–51. [PubMed]
  • Kebebew E , Greenspan FS , Clark OH , Woeber KA , McMillan A . Anaplastic thyroid carcinoma: treatment outcome and prognostic factors. Cancer 2005; 103: 1330–1335. [PubMed]
  • Orlandi F , Saggiorato E , Pivano G , Puligheddu B , Termine A , Cappia S și colab. Galectin-3 is a presurgical marker of human thyroid carcinoma. Cancer Res 1998; 58: 3015–3020. [PubMed]
  • Rotblat B , Niv H , André S , Andre S , Kaltner H , Gabius H și colab. Galectin-1 (L11A) predicted from a computed Galectin-1 farnesyl-binding pocket selectively inhibits Ras-GTP. Cancer Res 2004; 1: 3112–3118. [PubMed]
  • Elad-Sfadia G , Haklai R , Ballan E , Gabius HJ , Kloog Y . Galectin-1 augments Ras activation and diverts Ras signals to Raf-1 at the expense of phosphoinositide 3-kinase. J Biol Chem 2002; 277: 37169–37175. [PubMed]
  • Aizman E , Mor A , Levy A , George J , Kloog Y . Ras inhibition by FTS attenuates brain tumor growth in mice by direct antitumor activity and enhanced reactivity of cytotoxic lymphocytes. Oncotarget 2012; 3: 144–157. [PMC free article] [PubMed]
  • Blum R , Elkon R , Yaari S , Zundelevich A , Jacob-Hirsch J , Rechavi G și colab. Gene expression signature of human cancer cell lines treated with the Ras inhibitor salirasib (S-farnesylthiosalicylic acid). Cancer Res2007; 67: 3320–3328. [PubMed]
  • Wang Y , Nangia-Makker P , Tait L , Balan V , Hogan V , Pienta KJ și colab. Regulation of prostate cancer progression by galectin-3. Am J Pathol2009; 174: 1515–1523. [PMC free article] [PubMed]
  • Streetly MJ , Maharaj L , Joel S , Schey S A , Gribben JG , Cotter FE . GCS-100, a novel galectin-3 antagonist, modulates MCL-1, NOXA, and cell cycle to induce myeloma cell death. Blood 2010; 115: 3939–3948. [PMC free article] [PubMed]
  • Saggiorato E , Cappia S , De Giuli P , Mussa A , Pancani G , Caraci P și colab. Galectin-3 as a presurgical immunocytodiagnostic marker of minimally invasive follicular thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 5152–5158. [PubMed]
  • Xu XC , el-Naggar AK , Lotan R . Differential expression of galectin-1 and galectin-3 in thyroid tumors. Potential diagnostic implications. Am J Pathol 1995; 147: 815–822. [PMC free article][PubMed]
  • Newlaczyl AU , Yu LG . Galectin-3 – a jack-of-all-trades in cancer. Cancer Lett 2011; 313: 123–128. [PubMed]
  • Gartel AL , Serfas MS , Tyner AL . p21–negative regulator of the cell cycle. Proc Soc Exp Biol Med1996; 213: 138–149. [PubMed]
  • Shimura T , Takenaka Y , Tsutsumi S , Hogan V , Kikuchi A , Raz A . Galectin-3, a novel binding partner of beta-catenin. Cancer Res 2004; 64: 6363–6367. [PubMed]
  • Dumic J , Dabelic S , Flögel M . Galectin-3: an open-ended story. Biochim Biophys Acta 2006; 313: 616–635. [PubMed]
  • Ho MK , Springer TA . Mac-2, a novel 32,000 Mr mouse macrophage subpopulation-specific antigen defined by monoclonal antibodies. J Immunol 1982; 128: 1221–1228. [PubMed]
  • Macleod KF , Sherry N , Hannon G , Beach D , Tokino T , Kinzler K și colab. p53-Dependent and independent expression of p21 during cell growth, differentiation, and DNA damage. Genes Dev1995; 9: 935–944. [PubMed]
  • Fagin J A , Matsuo K , Karmakar A , Chen DL , Tang SH , Koeffler HP . High prevalence of mutations of the p53 gene in poorly differentiated human thyroid carcinomas. J Clin Invest 1993; 91: 179–184. [PMC free article] [PubMed]

Lasă un răspuns

Completează mai jos detaliile tale sau dă clic pe un icon pentru a te autentifica:

Logo WordPress.com

Comentezi folosind contul tău WordPress.com. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Google+

Comentezi folosind contul tău Google+. Dezautentificare /  Schimbă )

Poză Twitter

Comentezi folosind contul tău Twitter. Dezautentificare /  Schimbă )

Fotografie Facebook

Comentezi folosind contul tău Facebook. Dezautentificare /  Schimbă )

Conectare la %s

Acest sit folosește Akismet pentru a reduce spamul. Află cum sunt procesate datele comentariilor tale.